材料和试剂

1.5ml聚丙烯管
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：162-0177）
AmershamHyperfilm ^{TM ECL（GE Healthcare，目录号：28906836）}
纯化人重组E1（BOSTONBIOCHEM，目录号：K-995）
Qiagen Ni-NTA Spin Kit（QIAGEN，目录号：31314）
纯化人重组Ub（BOSTONBIOCHEM，目录号：K-995）
纯化的人重组Ub与突变的赖氨酸11（K11）残基（Ub-K11R）（BOSTONBIOCHEM，目录号：UM-K11R）
纯化的人重组Ub与突变的赖氨酸48（K48）残基（Ub-K48R）（BOSTONBIOCHEM，目录号：UM-K48R）
用Ub（K63）残基突变（Ub-K63R）（BOSTONBIOCHEM，目录号：UM-K63R）的纯化人重组Ub
10倍反应缓冲液（BOSTONBIOCHEM，目录号：K-995）
Mg-ATP溶液（BOSTONBIOCHEM，目录号：K-995）
4x非还原加载缓冲区（BOSTONBIOCHEM，目录号：K-995）
SDS-PAGE凝胶
脱脂奶粉
抗泛素抗体（Cell Signaling Technology，目录号：3936）
与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的山羊抗小鼠抗体（Bio-Rad Laboratories，目录号：170-6516）
Amersham ECL主要蛋白质印迹检测试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2232）
NaCl
KCl
Na 2 HPO 4
KH ₂ PO ₄
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
三碱基
大豆
甲醇
透析缓冲液（见配方）
1x PBS（见食谱）
1x PBST（见配方）
转移缓冲区（见配方）

设备

孵化器（VWR，型号：1545）或水浴
蛋白质电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini PROTEAN ^3细胞）
Western印迹装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini Trans-Blot Cell）
X光片处理器（PROTEC，型号：OPTIMAX）

程序

使用QIAGEN Ni-NTA Spin Kit纯化6x His标签的拟南芥E2 UBC22（His-UBC22），并按照制造商的说明进行。然后将纯化的蛋白质在透析缓冲液中透析过夜。
在1.5ml聚丙烯管中制备反应样品。添加不同的组件，如下所示。为了测试二聚体的特异性连接，野生型Ub可以被不同的Ub突变体取代，每个Ub突变体都具有突变的一个特定赖氨酸残基（Ub-K11R，Ub-K48R或Ub-K63R）。
组件                 添加量或最终浓度
10倍缓冲区                     2.0μl
E1                          ;      0.2μM
E2                          ;     5.0μM
Ub                          ;     62.5μM
Mg-ATP溶液        1.0 mM
ddH ₂ O                         补充20μl
将反应样品在30℃下在水浴或培养箱中孵育4小时。
在每个反应样品中加入7μl4x SDS非还原加载缓冲液和1μlddH 2 O。
在95℃下处理样品5分钟。
Bio-Rad Mini PROTEAN ^® 3细胞凝胶仪用于蛋白质电泳。在15％SDS-PAGE分解凝胶上加载半量样品，并用4％堆叠凝胶，并在120V下运行凝胶130分钟，以分离蛋白质。
使用Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell将蛋白质在120V下转移到一片PVDF膜上120分钟。转移装置放入带有冰的桶中，以减少转移过程中的热量产生
在10 ml含有5％脱脂奶粉的1x PBS中孵育0.5小时，以进行封闭治疗。
在含有3％脱脂奶粉的10ml 1x PBST中，在4℃下将膜与一抗（抗泛素抗体，抗体稀释比为1:40,000）孵育过夜。
在室温下，用1×PBST洗涤膜3次（20ml，每次10分钟）
在含有3％脱脂奶粉的1×PBST中室温孵育1小时的二抗（羊抗鼠抗体缀合抗体，抗体稀释比为1:7,000）的膜。
在室温下，用1×PBST洗涤膜3次（20ml，每次10分钟）
根据制造商的说明书（图1），用ECL主要蛋白质印迹检测试剂检测信号。使用1-10分钟作为胶片曝光时间的初始范围，具体取决于信号强度。

图1.通过His-UBC22进行的Ub二聚体形成测定为了确定拟南芥UBC22的活性，将如图顶部所示的各种成分加入到具有（泳道2,4,6和8）或不含His-UBC22（泳道1,3,5和7）的反应管。将反应管在30℃下孵育4小时。然后将样品进行SDS-PAGE（具有4％堆积和15％分辨凝胶）。通过使用抗Ub抗体的Western印迹检测到Ub和Ub二聚体。在图的右侧表示免费的Ub（Ub）和Ub二聚体（Ub 2+）。对于K11R突变体，当添加His-UBC22蛋白时，没有观察到新的Ub二聚体形成。由于轻微的杂质，重组K11R蛋白中有一个弱带，略高于从野生型Ub和其他Ub突变体合成的Ub二聚体。执行了三个独立的实验，具有相似的结果（Wang等人，2016年的图;图6在手稿中： http://jxb.oxfordjournals.org/content/early/2016/04/10/jxb.erw142。完整）。

数据分析

纯化的拟南芥在体外Ub二聚体形成测定中测试与6x His标签（His-UBC22）融合的重组E2 UBC22。如图1所示，当将His-UBC22加入反应（泳道2与泳道1相比）时，可以检测到Ub二聚体，表明UBC22催化游离二聚体形成的生化活性。此外，当使用Ub-K48R突变体或Ub-K63R突变体时，观察到类似的二聚体形成，其缺少K48残基或K63残基（泳道5与泳道5相比，或泳道8与泳道7相比）。有趣的是，当使用缺乏K11残基的Ub-K11R时，产生很少的二聚体（与泳道3相比，泳道4）。这些结果表明，UBC22可以通过Ub的K11残基特异性地在体外催化Ub二聚体形成。进行了三次独立实验，得到了类似的结果。

笔记

该测定旨在研究E2酶的比活性。重组蛋白的纯度或影响蛋白质活性的任何条件都可能影响结果。商业E2蛋白，如人E2 Ube2S，可能对阳性对照有好处。
根据所测试的E2的活性，可以在测定中形成和检测聚-UP链。

食谱

透析缓冲液
10mM Tris-HCl（pH7.5）
50 mM NaCl
1x PBS
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH PO 4
调整至pH 7.4
1x PBST
0.1％Tween-20在1x PBS中
转移缓冲区
25 mM Tris碱基
192mM甘氨酸
20％（v/v）甲醇

致谢

我们非常感谢加拿大自然科学和工程研究理事会（NSERC）（发现资助）向HW提供财务支持。

参考

Wang，S.，Cao，L.and Wang，H。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27069118"目标="_ blank">拟南芥泛素结合酶UBC22是雌配子体发育所必需的，可能涉及Lys11连锁的泛素化。 J Exp Bot 67（11）：3277-3288。