材料和试剂

微孔板，96孔，黑色，F底（Greiner Bio One，目录号：655076）
盖板（24 x 40 mm）（Carl Roth，目录号：1870.2）
标准显微镜幻灯片（Carl Roth，目录号：0656.1）
10 ml一次性注射器（Carl Roth，目录号：0058.1）
0.35 x 25毫米内根针根管冲洗（Vedefar，Dilbeek，目录号：99010）
92毫米培养皿（SARSTEDT，目录号：82.1473）
Whatman纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA10347511）（可选）
塑料处理袋（Carl Roth，目录号：E706.1）
双面胶框（Gene Frame）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Fisher Scientific ^{TM，目录号AB0576）}
移液头（1000μl，200μl，10μl）
PCR管
分生孢子。表示HyPer-2或SypHer的禾谷镰孢表达（，优选新鲜，未冷冻）
pC1-HyPer-2（Addgene，目录号：42211）
pC1-HyPer-C199S（SypHer）（Addgene，目录号：42213）
PCR引物用于HyPer和SypHer扩增：正向引物5'-ATG GAG ATG GCA AGC CCA GCA GGG CGA GAC GAT GT-3';反向引物5'-GCT TTT AAA CCG CCT GTT-3'
浸入油，Immersol W 2010（Pulch + Lorenz，目录号：444969-0000-000）
过氧化氢30％（Carl Roth，目录号：9681.4）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：000000010197777001）
硝酸钙四水合物，Ca（NO 3 3）2·4H 2 O（Carl Roth，目录号：X886.1）
磷酸二氢钾，KH 2 PO 4（Carl Roth，目录号：P018.1）
硫酸镁七水合物，MgSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：230391-500G）
氯化钠，NaCl（Carl Roth，目录号：9265.1）
硼酸，H 3 BO 3（Carl Roth，目录号：6943.1）
硫酸铜（II）五水合物，CuSO 4·5H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：209198-250G）
碘化钾，KI（Carl Roth，目录号：6750.1）
硫酸锰（II）一水合物，MnSO 4 H 2 O（Carl Roth，目录号：7347.2）
钼酸铵四水合物，（NH 4）6族Mo 7 O 24·4H 2/sub > O（Sigma-Aldrich，目录号：09880-100G）
硫酸锌七水合物，ZnSO 4·7H 2 O（Carl Roth，目录号：7316.1）
氯化铁（III）六水合物，FeCl 3·6H 2 O（Carl Roth，目录号：7119.1）
氯仿
蔗糖（Carl Roth，目录号：9097.2）
颗粒状琼脂（BD，目录号：214530）
解答A（见配方）
解决方案B（见配方）
悬挂D（见配方）
最小介质（见配方）

设备

微板多模式阅读器（例如，Berthold Technologies Multimode Microplate Reader Mithras ^² LB 943，BERTHOLD TECHNOLOGIES，型号：Mithras2 LB 943），配备荧光激发滤光片（380×10nm和485×14nm，例如，BERTHOLD TECHNOLOGIES，目录号：40087-01和40271-01），荧光发射滤光片（520×10nm，例如，BERTHOLD TECHNOLOGIES ，目录号：38836-01）和注射器（例如，，BERTHOLD TECHNOLOGIES，型号：54116）
Neubauer计数室改善（Carl Roth，目录号：T729.1）
共焦激光扫描显微镜（例如，安装在具有电动载物台的卡尔蔡司Axio Imager.Z2显微镜上的LSM 780）
40x物镜（例如，Carl Zeiss C-apochromat Carl Zeiss 40x/1.20W Korr M27）
28℃培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus B20/UB20）
固体激光器405nm，50mW
氩离子激光458,488和514nm，30mW
多通道移液器（Eppendorf，目录号：3122000035）
移液器：10-100μl（Eppendorf，目录号：4920000059），100-1,000μl（Eppendorf，目录号：4920000083）
300 mm海德堡扩展（Dezember，Fresenius Kabi Deutschland，目录号：2873112）

软件

平板阅读器软件（例如，，Berthold MikroWin Lite软件[Berthold Technologies]）
电子表格软件程序（例如，，Excel [Microsoft]）
ImageJ（版本1.46r， http://imagej.net/）

程序

生成HyPer和SypHer报道突变体
1. 使用正向引物5'-ATG GAG ATG GCA AGC CCA GCA GGG CGA GAC GAT GT-3'和反向引物5'-GCT TTT从pC1-HyPer-2和pC1-HyPer-C199S（SypHer）扩增HyPer和SypHer的序列AAA CCG CCT GTT-3'（可以在引物的5'末端添加限制酶识别位点，以便于在所需的二元载体中克隆）。
2. 根据标准方案转化真菌。对于 F。 graminearum ，作者参考Maier等人。（2005）注意：建议用荧光显微镜或RT-PCR检查HyPer和SypHer的表达。
96孔板分析
以下段落描述了使用96孔板和多模式阅读器分析"f"F的反应的分析。禾谷镰刀菌菌丝体至H 2 O 2 O 2，DTT和测试物质A和B，其可以是待测定的给定浓度下的任何选择物质因为其可能导致F中的H 2> 2 2 突发。 graminearum 。
1. 用100μl基本培养基填充黑色96孔板的每个孔，等待30分钟直到固化。
2. 根据图1所示的移液方案，将200个分生孢子（即，分别为10μl的20只分生孢子悬浮液）接种在96孔板中。 >
  
  图1.在荧光板读数器中装载和接种待分析的96孔测定板的方案每孔用100μl基本培养基填充，并接种野生型分生孢子（柱3和4），SypHer（第5列和第6列）和HyPer（第7-12列）。第1列和第2列保持未接受控制。
3. 盖上96孔板，将其放入用无菌ddH 2 O加湿的塑料袋中，以防止脱水，并在28℃下在永久黑暗中孵育2天。
4. 在第3天，应进行HyPer测定。长时间的孵化导致了扰动测量的气生菌丝的积累。
5. 启动多模式阅读器，并允许内部室达到28°C。
6. 按照制造商的说明注入喷油器。作为示例，注射器1可以用150mM H 2 O 2 O 2溶液，具有150mM DTT溶液的注射器2，具有测试物质A的注射器3和注射器4的测试物质B的浓度为孔中的最终浓度的三倍。
7. 在读卡器软件中编程测量循环：
  1. 选择激发滤波器"380 x 10"和发射滤波器"520 x 10"，用于测量HyPer在其降低状态下发出的荧光，激发滤波器'485 x 14'（发射滤波器'520 x 10'用于氧化状态）。
  2. 配置注射器。例如，注射器1将在循环31注入50μl的测试物质，注射器2将在循环61处注入50μl另外的物质。如果可能的话，在这两种情况下都可以选择缓慢到中等的注射速度以防止溢出。 > 注意：用户应避免长时间的测量循环，因为HyPer响应通常非常快。如果在荧光测量恢复之前将物质注入所有孔，则立即反应可能已经结束。然而，作者建议在注射后立即测量一口井。
8. 使用多通道移液管向所有孔中加入100μlddH 2 O，并在28℃放置30分钟。
9. 将板插入读板器并开始测量循环。
10. 运行后，在电子表格软件程序中导出原始数据进行进一步分析。
11. 对于比率计算，将在该A1井中用485nm激发后的荧光发射值（FEV）除以在该特定孔中用380nm激发后的FEV（等式1）。
  
  >注意：等式1分别表示用485nm和380nm激发后测量的荧光强度比的计算。
12. 将其应用于所有井。平均每个时间点生物重复的比例（即，即，介质对照的A1至H2的孔），并计算标准偏差。绘制y坐标上的平均比值与x轴上的时间。根据上述程序对H 2 O 2和DTT的真菌反应的测量通常将产生如图2所示的曲线。
  
  图2.对外部H 2 O 2和二硫苏糖醇（DTT）的真菌反应的比例时间过程测定。表达HyPer，SypHer的菌丝的H 2 O 2（50mM）和DTT（50mM）诱导比[485/380nm]变化的时间变化进行比较到野生型（无荧光团）和培养基控制（MM）。如文中所述将菌丝体置于96孔板中，并用荧光计分析。误差条表示标准差。
共聚焦激光扫描显微镜分析
本段描述了用于原位显微镜对外部H 2 O 2 O 2或任何测试物质的真菌反应的流体室的结构和用途。流体腔室的组件如图3和视频1所示
1. 在乙醇或紫外光中表面灭菌显微镜载玻片，例如，
2. 取下覆盖基因框架和窗口的盖子，并将其粘贴到幻灯片上。
3. 将40μlMM填入框架中，并立即用第二张幻灯片盖住，以获得室内均匀的表面
4. 30分钟后，通过小心地移动上盖板，通过侧面小心移动，并用300个分生孢子（15μl的20个分生孢子微悬浮液）分泌表达HyPer或SypHer的突变体接种琼脂表面。 />
5. 在永久黑暗中，在28℃下孵育不育培养皿（加入500μl无菌ddH 2 O，并使用移液器吸头作为仰角）24小时。
6. 第二天，从第一个基因框架中移除覆盖框架的第二个基因框架的盖子和窗口以及剩余的覆盖箔片。取第二个基因框架，并将其附加到幻灯片上的第一帧。
7. 从两个基因框架中切出1毫米和5毫米片，以便分别注射和排出测试物质（见图3）。
  
  图3.用于同时进行图像采集和注入测试物质的定制流体室的组装。主要文本中的详细说明（另见视频1）。
  
  <！ - flashid2080v146开始 - >
  视频1.装配流体腔
  
  <！ - flashid2080v146结束 - >
8. 从基因框架中移除剩余的覆盖箔。
9. 在第二个框架上放置一个盖子滑块到伸出到排水口。它作为一个小容量的容积。
10. 用带有内针针头的注射器冲洗带有ddH 2 O的流体腔，附着在根管上。
11. 使用注射器使用测试物质（例如，50mM H 2 O 2 O 2）预先填充海德堡延长部分，并将其附着到另一个内针上。
12. 将流体室安装到CSLM的阶段。
13. 将内针插入注射口，用胶带固定海德堡延长杆和内针的位置。
14. 以最短的采集时间和重复率在40分钟内使用405和488 nm的激发程序对xyt帧（横向分辨率512 x 512，颜色深度：8位）进行顺序采集。在493到598 nm的范围内检测两个通道的荧光信号。使用40x/1.2W的图像采集目标。
15. 开始扫描调整两个通道的激光强度和增益，使得荧光信号强度在两个通道（405和488nm激发）中近似水平。图4示例性地表示了F的菌丝中的HyPer荧光。 graminearum 。
  
  图4. F的荧光发射和亮场图像。 graminearum 表达HyPer的菌丝
16. 在10分钟内开始注入监测器稳态荧光之前。
17. 继续扫描时小心注射测试物质。为了防止显微镜损坏，请始终观察显微镜载玻片的溢出。注入完全清除初始添加的ddH ₂ O所需的体积。
18. 至少30分钟以上的Aquire xyt框架。
19. [可选]清洗第一个测试物质，用ddH 2 O 2清洗室一次，并使用新的预填充的海德堡延长重复注射。使用吸收纸（例如，Whatman论文）在排水口处收取多余的量。
20. 对于数据分析，使用ImageJ打开xyt堆栈。
21. 通过"ROI管理器"工具和"测量堆栈"插件，获取每个通道随时间的FEV值并测量一个或多个定制区域中的荧光强度。计算488 nm/405 nm比例（与等式1相似），并在y轴上绘制x轴上的采集时间。
22. 对于488nm/405nm比例的视觉表示，遵循说明书（ link ）。图5示例性地示出了菌丝的488nm/405nm假色比图像。
  
  图5. 488nm/405nm比率的假彩色图像

数据分析

HyPer测量提供了高度可重现和可靠的H 2菌丝的H 2 O 2 O 2波动的数据。 graminearum 。 96孔测定的设置是容易的并允许大量的重复。这保证统计准确性。 CLSM分析尽管在技术上更复杂，但是在核分裂或定向生长期间能够监测细胞内H 2 O 2 O 2分配（例如，）（Mentges和Bormann，2015）。对于CLSM测定的关键是由由基因框架分开的彼此顶部堆叠的两个对象载玻片提供的平面琼脂表面。

食谱

解决方案A
100g/L Ca（NO 3 3）2·4H 2 O
通过过滤灭菌
解决方案B
20g/L KH PO 4
25g/L MgSO 4·7H 2 O
10g/L NaCl
通过过滤灭菌
暂停D
60g/L H 3/3 3/3< 3>
390g/L CuSO 4·5H 2 O
13 mg/L KI
60mg/L MnSO 4·H 2 O
51mg/L（NH 4）6 O 24 2 O
5.48g/L ZnSO 4·7H 2 O
932mg/L FeCl 3·6H 2 O
通过加入0.1％（v/v）氯仿消毒
最小介质（MM，1 L）
10ml溶液A
10ml溶液B
10g蔗糖
1ml悬浮液D
16克琼脂

致谢

作者感谢V.V.V博士。 Belousov提供HyPer和SypHer质粒，B.Hadeler和C.Kröger提供技术援助。

参考文献

Belousov，V.V.，Fradkov，A.F.，Lukyanov，K.A.，Staroverov，D.B.，Shakhbazov，K.S.Terskikh，A.V.和Lukyanov，S。（2006）。细胞内过氧化氢的遗传编码荧光指示剂。 ; Nat方法 3（4）：281-286。
Guo，H.，Aleyasin，H.，Dickinson，B.C.，Haskew-Layton，R.E。和Ratan，R.R。（2014）。用于生物应用的过氧化氢成像的最新进展。细胞生物学 4：64.
Kardash，E.，Bandemer，J.和Raz，E。（2011）。使用荧光共振能量转移生物传感器在活胚中成像蛋白质活性。/a> Nat Protoc 6（12）：1835-1846。
Maier，F.J.，Malz，S.，Lösch，A.P.，Lacour，T。和Schäfer，W。（2005）。开发禾谷镰刀菌的高效基因靶向系统使用聚酮化合物合酶基因的破坏作为可见标记。 FEMS酵母研究组织5（6-7）：653-662。
Mentges，M。和Bormann，J。（2015）。营养和致病菌丝中过氧化氢动力学的实时成像镰刀菌镰刀菌。 5：14980.