材料和试剂

Remel ^TM塑料培养皿（直径85mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R80085）}
无菌聚苯乙烯铺展棒（SARSTEDT，目录号：86.1569.005）
碳青霉烯（CAR100）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：CT0006B）
Colistin（CT10）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：CT0017B）
多粘菌素（PB300）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：CT0044B）}
光盘分配器（包含在上述每个测试光盘的套件中）
WT对照的蓝藻培养物和要测试的突变体
硼酸，H 3 BO 3（Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
锰（II）四水合物，MnCl 2·4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：221279）
硫酸锌七水合物，ZnSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：Z1001）
钼酸钠脱水，Na 2 O 3 O 4·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：331058）
硫酸铜五水合物，CuSO 4·5H 2 O（Thermo Fisher Scientific，Fischer Scientific，目录号：C493-500）
硝酸钴（II）六水合物Co（NO 3 3）2·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：239267）
硝酸钠，NaNO 3（Scharlab，目录号：SO05010500）
硫酸镁七水合物，MgSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
CaCl 2·2H 2 O（Scharlab，目录号：CA01981000）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
Na 2 -EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：27285）
柠檬酸铁铵（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
碳酸钠，Na 2 CO 3（Sigma-Aldrich，目录号：71345）
磷酸氢二钾，K 2 HPO 4（EMD Millipore，目录号：105104）
硫代硫酸钠（固体）（Sigma-Aldrich，目录号：217263）
Difco Bacto-agar（BD，目录号：214530）
TES（Sigma-Aldrich，目录号：T6541）
100x BG11无Fe，磷酸盐，碳酸盐（见食谱）
1,000x柠檬酸铁铵（见食谱）
1,000x Na 2 CO 3（参见食谱）
1,000x K 2 HPO 4（见配方）
BG11固体琼脂平板（参见食谱）
1 M TES/NaOH缓冲液，pH 8.2（参见食谱）

设备

带有排气帽（TC烧瓶T25）的细胞培养瓶（50-250ml）（SARSTEDT，目录号：83.3910.002）
UV/VIS分光光度计（GlobalMarket，PG Instruments，型号：T90 +），用于测量细胞培养物的吸收（OD 730）。
Multisizer ^TM用于计数细胞的库尔特计数器（Beckman Coulter，型号：Z Series Coulter Counter）
层层罩（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Heraguard ^TM Eco Clean Bench）
用轻轻摇动培养箱（80-120转/分钟）（I 〜60-100μEm -2至^-1）和温度调整到30°C（Eppendorf，型号：New Brunswick ^TM Innova ^® 43）

程序

注意：建议使用无菌层流罩在无菌条件下处理蓝细菌培养物。

将100ml BG11培养基用WT和突变体的蓝细菌细胞在初始OD 730接种，并使其生长2-3天，直到用分光光度计在730nm测量培养物的OD在0.4-0.8之间。
使用Beckman Coulter细胞计数器计数细胞。或者，如果细胞计数器不可用，则可以使用血细胞计数器计数细胞。
在无菌条件下工作，用BG11稀释蓝细菌培养物至100,000个细胞/ml
分别在含有40ml固体BG11培养基的培养皿上分散1ml稀释培养物（含有100,000个细胞）的WT和突变株。将板放在无菌罩中，直到液体蒸发。
将三分之一的抗生素盘放置在WT和突变株的每个平板上。使用每种待测试菌株的至少三种生物重复。
将培养皿放在轻度和30℃的培养箱中，并保持孵育（1-2周），直到可见绿色菌落。
测量每个抗生素盘周围的抑制区域到最后的mm（图1）。如果与WT相比，突变体显示较高的抑制区，则该表型可能是干扰细胞壁生物发生/功能的突变的结果。

图1.抗生素敏感性试验测定 WT（A，C，E）和Δ（B，D，F）对不同抗生素的敏感性显示为它们的抑制区（ZOI）。 Polymixyn B诱导的ZOI分别在WT（A）和Δgt突变体（B）中分别为0.55（±0.1）cm和0.8（±0.08）cm。羧苄青霉素的ZOI对于WT（C）为1.6（±0.19）cm，对于Δdeg（D）为2.4（±0.25）cm。粘虫素类似地影响了WT（E）和Δdeg（F），ZOI为0.4厘米。黑色箭头表示测量的抑制区域。改编自Cheregi等人。（2015）。

数据分析

通过四个生物重复计算抑制面积（cm）和标准偏差的平均直径。每个生物复制品由3个技术重复表示;技术复制呈现相同的抑制区域。这些数据显示在Cheregi等人的表3和图3中。（2015）。

笔记

该协议是从以前发表的Trautner和Vermaas研究（2013）改编而来的，并且在Cheregi等人（2015）中进行。抗生素的有效期在有效期后下降。

食谱

微量矿物质（1升）
2.86g H 3 3 3
1.81g MnCl 2·4H 2 O 2/
0.22g ZnSO 4·7H 2 O
0.39g Na 2 MoO 4·2H 2 O
0.079g CuSO 4·5H 2 O
0.049g Co（NO 3 3）2·6H 2 O
100倍BG11无铁，磷酸盐，碳酸盐（1升）
149.6g NaNO 3
7.5g MgSO 4·7H 2 O·
3.6g CaCl 2·2H 2 O ○
0.60g柠檬酸（或0.89g柠檬酸钠，二水合物）
1.12ml 0.25M Na 2 -EDTA，pH8.0
100毫升微量矿物质
其他组件
柠檬酸铁铵，6mg/ml（1,000x）：600mg/100ml dH 2 O
Na 2 CO 3（1,000×）：2g Na 2 CO 3/100ml/100ml/2 O
K 2 O 3 HPO 4（1,000×）：3.05g K 2 HPO 4 /每100ml dH 3 2 O
BG11液体介质（1升）
10毫升100克BG11无铁，磷酸盐，碳酸盐
1毫升1,000倍柠檬酸铁铵

1毫升1,000×K 2 HPO 4
BG11固体琼脂平板（1升）
对于琼脂平板，请加上：
10 ml 1 M TES/NaOH缓冲液pH 8.2（长期储存在冰箱中）
3g硫代硫酸钠（固体）
15克Difco Bacto-agar
在121℃高压灭菌30分钟
1 M TES/NaOH缓冲液，pH 8.2
在蒸馏的H 2 O中溶解229.2g的TES 所得到的解决方案应该是清楚的
使用浓缩的NaOH溶液将pH值调至8.2

致谢

这项工作得到了瑞典能源机构（C. Funk）的资助。

参考文献

Bauer，A.W.，Kirby，W.M.M.，Sherris，J.C.和Turck，M。（1966）。通过标准化单磁盘方法进行的抗生素敏感性测试。 Am J Clin Pathol 45（4）：493-496。
Cheregi，O.，Miranda，H.，Gröbner，G.and Funk，C。（2015）。蓝藻中的Deg蛋白酶家族灭活集胞藻 sp。 PCC 6803对外部单元格层有影响。 < J Photoch Photobio B 152：383-394。
Cheregi，O.，Wagner，R。和Funk，C。（2016）。了解蓝细菌Deg/HtrA蛋白酶。 Front Plant Sci 7：624。
Miranda，H.，Cheregi，O.，Netotea，S.，Hvidsten，T.R.，Moritz，T.and Funk，C。（2013）。共表达分析，蛋白质组学和代谢组学研究的影响Deg/HtrA蛋白酶三重突变体在集胞藻中。 PCC 6803暴露于温度和高光照条件下。 78：294-311。
Tam，L.X.，Aigner，H.，Timmerman，E.，Gevaert，K.and Funk，C。（2015）。鉴定三种Deg/HtrA蛋白酶底物的蛋白质组学方法蓝细菌集胞藻PCC 6803。
生物化学J 468（3）：373-384。
Trautner，C.和Vermaas，W. F.（2013）。 sll1951 基因编码表层集胞藻的蛋白质菌株PCC 6803。 < J Bacteriol 195（23）：5370-5380。