材料和试剂

培养皿，三通孔94 x 15mm（Greiner Bio One，目录号：633 185）
滤纸（Whatman，目录号：1001-090）
石蜡膜（Parafilm，目录号：PM992）
植物容器盆，3升（国家农化部经销商，目录号：POTS34）
约翰·内斯堆肥2号（Westland Horticulture）
方形培养皿100 x 100 x 20毫米（SARSTEDT，目录号：82.9923.422）
玻璃巴斯德移液器（VWR，目录号：14673-010）
镰刀菌菌株GZ3639（Proctor等人，1995）
植物琼脂（Duchefa，目录号：P1001.1000）
苯并咪唑（在-20℃下以等分试样储存的乙醇中的500mM储备溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：194123）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）

设备

孵化器（20°C）
玻璃屋（剑桥HOK生产玻璃温室）（20-22℃，16小时光/8小时深光光周期，在300μmol/平方米以上）和70％相对湿度）
植物生长室（20℃，具有16小时光/8小时200微米/秒的深光周期和70％相对湿度）
数码相机（尼康，型号：COOLPIX P500，NIKKOR 36X宽光学ZOOM ED VR，4.0 - 144 mm，1：3.4 - 5.7）
复印台（RPS Studio RS-CS920复印架）
灯（冷光荧光照明系统）

软件

斐济（ http://fiji.sc/）
注意：斐济是一款使用与许多捆绑插件相同功能的开源软件。因此，此处提供的图像分析可以使用ImageJ执行。

程序

将小麦种子放在含有2张滤纸和6 ml无菌水的94 mm直径的培养皿中
用一片石蜡膜密封板，并在20℃下在培养箱中在黑暗中发芽3天。
将移栽幼苗移植到含有最多6棵幼苗/盆的含有约翰·内斯堆肥2号的3L盆中。
在温度为20-22℃的温度控制环境条件下，在300μmol/平方米的高光照条件下，在16小时光/8小时暗光照条件下，在温室内种植植物， 70％相对湿度。
在3叶期（生长阶段13; [Zadoks等人，1974]）约20天后，从距离叶基部固定距离的第二叶切割8cm的部分（图1A）注意：8个叶片适合所使用的方格培养皿。

图1.分离叶测定的设置 A.用于测定的3叶期的小麦第二叶的部分。 B.将不同的叶片部分放置在方形培养皿中，其切割端保持在上部和下部琼脂部分之间。
切割后立即将正面侧面朝上的叶片放置在正方形陪替氏培养皿的表面。将切割的末端放在含有0.5mM苯并咪唑的1％植物琼脂pH 5.7的夹心之间（图1B，视频1）。
注意：从板材中心除去琼脂可防止在叶片接种时过多的真菌生长，另外除去可用于形成三明治的琼脂部分。苯并咪唑用于延缓叶片衰老。

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视频1.叶片的放置在琼脂部分之间结束

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用玻璃巴斯德移液管的尖端刺穿每个叶片部分的中心，并用含有10分钟/分钟分子/ml的0.02％（v/v）吐温-20溶液的4微升滴定液> F。禾谷镰刀菌菌株GZ3639如前所述（Ali等人，2015）制备。
在叶片下面的板中加入2ml水以保持高湿度，并用一块石蜡膜密封板，然后在生长室中在20℃，16小时光/8小时黑暗循环下孵育。 > 注意：尝试将您的铭牌始终保持在同一水平，并在您的成长室或成长柜内。您的平板内的冷凝水平可能会有所不同，并影响可重现的疾病发展。
在接种后4天分析叶片部分（图2）注意：您也可以跟踪感染过程中的进度。在这种情况下，每天照片你的叶节和下面的过程分析（数据分析）。
重复实验至少三次，每次每次处理包括6个平板，每个平板包括每个小麦基因型的两个叶片段。

数据分析

将数码相机放置在复印机架上，校准高度和光线，以45°角从侧面完全照亮方形陪替氏培养皿。
注意：重要的是确保照明在所有的叶片部分，特别是感染的区域。不均匀的照明将影响感染区域的准确描述，从而影响其测量。有关如何使用副本的更多详细信息，请访问： http://www.jiscdigitalmedia.ac.uk/toolkit/digitisation-equipment/the-copy-stand
拆下盖板，并用放置在视野内的标尺拍摄叶片部分。相机设置如下：ISO 160，F-stop 3.4，快门速度1/30。
注意：图像的质量是准确测量的重要决定因素。根据您的光线条件调整相机设置。重要的是要确保受感染的区域是焦点，以使您的图像清晰，从而使您的测量准确。
以TIFF格式收集实验的所有照片，并使用斐济软件测量疾病叶面积（Schindelin等人，2012年）。
打开斐济的所有照片，并创建一堆所有图像（'Image'>'Stacks'>'Image to stacks）。
将RGB图像转换为8位二进制图像（'Image'>'Type'>'8-bit'）。
使用您拍摄的标尺的已知距离设置刻度。选择按钮直线，沿着标尺的已知距离画一条线。设置比例（'分析'>'设置比例'）。添加已知距离并选择您选择的单位（例如，cm）。
注意：为了确保您的比例是正确的，请重复使用"直线"工具，并测量标尺的已知距离并比较结果（"分析">"度量"）。
裁剪您的图像，将您的分析仅集中在叶片部分。选择"矩形"按钮，并定义您感兴趣的区域。裁剪图像（'Image'>'Crop'）之前，确保您的不同图像中的所有叶片都包含在您的选择中。
要执行自动粒子分析，第一步是设置图像的阈值。这告诉粒子分析感兴趣的对象（感染区域）与背景（非感染区域）不同。手动校准阈值，直到黑色区域适合感染区域（"图像">"调整">"阈值"）（图2）。
要自动测量感染区域，请使用"分析粒子"（"分析">"分析粒子"）工具。在"大小"框中设置最小和最大面积（图2）。在"显示"设置"覆盖轮廓"框内选中，然后勾选"显示结果"，"总结"和"原位展示"框（图2）。
注意：要知道要选择的最小尺寸，您可以用手写选择工具手动测量图片中最小的粒子。
结果将显示在表格中，并且您的图像上将标识相应的测量颗粒。表格中的结果可以复制并粘贴到Excel文件中。

图2.斐济图像分析管道。在接种后四天，通过图像分析分析叶片切片。将相应的RGB图像转换为二进制图像。为了自动测量感染区域，在分析之前手动设置阈值。

笔记

如果您想比较不同的基因型或治疗方法，通过随机分配培养皿中的叶子来避免阻滞作用。

致谢

这项工作得到了爱尔兰科学基金会（项目编号10/IN.1/B3028和14/1A/2508）的支持。该协议的一部分是从先前描述的分离的叶病实验（Browne和Cooke，2004; Perochon等人，2015）中改编的。作者感谢Pierre Grandjean的技术援助和Emmanuel G. Reynaud（UCD）协助形象分析。

参考文献

Ali，SS，Gunupuru，LR and Doohan，FM（2015）。 Visual评估镰刀菌幼苗（FSB）和禾谷镰刀菌病（FHB）病在大麦中的严重程度。 5（12）：e1507。
Browne，RA（2009）。调查成为部分抗病性的成分，在体外确定，以及小麦中对镰孢霉病（FHB）的耐药性的概念。 Eur J Plant Pathol 123（2）：229-234。
Browne，RA和Cooke，BM（2004）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://link.springer.com/article/10.1023%2FB%3AEJPP.0000010143.20226.21"target =" _blank">开发和评估体外分离的叶片测定法，在小麦中预先筛选抗镰孢霉病疫苗。 Eur J Plant Pathol 110：91-102。
Li，X.，Zhang，JB，Song，B.，Li，HP，Xu，HQ，Qu，B.，Dang，FJ and Liao，YC（2010）。抗镰刀菌小麦中的枯萎病和幼苗枯萎与细胞色素的激活有关 p450 基因。 植物病理学 100（2）：183-191。
Perochon，A.，Jianguang，J.，Kahla，A.，Arunachalam，C.，Scofield，SR，Bowden，S.，Wallington，E.and Doohan，FM（2015）。< a class =插入文件"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26508775"target ="_ blank"> TaFROG 编码了一种Pooideae 孤儿蛋白，与SnRK1相互作用，并增强对真菌致病性真菌镰刀菌禾本科植物的抵抗力。禾本科植物。植物生理学169（4）：2895-2906。 br />
Proctor，RH，Hohn，TM和McCormick，SP（1995）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589414"target =" _blank">由头孢霉烯毒素生物合成基因的破坏引起的玉米赤霉病的毒力降低。分子植物微生物相互作用 8（4）：593-601。 br />
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B 。，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P。和Cardona，A.（2012）。斐济：用于生物图像分析的开源平台。 Nat方法 9（7 ）：676-682。
Shin，S.，Kim，KH，Kang，CS，Cho，KM，Park，CS，Okagaki，R。和Park，JC（2014）。用镰刀菌镰刀霉接种的韩国小麦幼苗中评估镰刀菌抗病性的简单方法。 a>植物Pathol J 30（1）：25-32。
Zadoks，JC，Chang，TT和Konzak，CF（1974）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-3180.1974.tb01084 .x/abstract"target ="_ blank">谷物生长阶段的十进制代码。 Weed Research 14：415-421。