材料和试剂

50ml康宁管（Corning，目录号：430829）
1.5ml Eppendorf管（Treff，目录号：96.07246.9.01）
30ml离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3138-0030）}
0.2μmPES膜过滤器（Dominique Dutscher，目录号：051732）
Vivaspin 20，MWCO 30,000 Da集中器（Sartorius，目录号：VS2022）
HisTrap FF 1 ml柱（GE Healthcare，目录号：17-5319-01）
Superdex S200 10/300 GL柱（GE Healthcare，目录号：17-5175-01）
带密封剂的24孔VDX板（HAMPTON RESEARCH，目录号：HR3-170）
22毫米封面（HAMPTON RESEARCH，目录号：HR3-233）
E。大肠杆菌BL21（DE3）菌株（New England Biolabs，目录号：C2527I）
Luria Broth（LB）培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12780-052）}
卡那霉素（Euromedex，目录号：EU0420）
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Euromedex，目录号：EU0008）
消泡剂204（Sigma-Aldrich，目录号：A6426）
苯佐酶核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：E1014）＆nbsp;
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：56749）
乙醇无水无水（CARLO ERBA试剂，目录号：308607）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
PEG 3350（Sigma-Aldrich，目录号：88276）
液氮（LN 2 2）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7757）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP310）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10553515）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U1250）
二硫苏糖醇（DTT）（Euromedex，目录号：EU0006）
cOmplete ^TM蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
双三丙烷（Sigma-Aldrich，目录号：B6755）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）
Tris基（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10376743）
十二烷基硫酸钠（SDS）10％（Euromedex，目录号：EU0760）
溴酚蓝（EMD Millipore，目录号：108122）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
盐酸37％（CARLO ERBA试剂，目录号：403871）
氢氧化钠（EMD Millipore，目录号：1064621000）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤/结合缓冲液（见配方）
洗脱缓冲液（见配方）
大小排除缓冲区（见配方）
SDS-PAGE沉积缓冲液（5x DB）（参见食谱）
20％（v / v）乙醇（参见食谱）
6 N盐酸溶液（用于pH调节）（见配方）
10 M氢氧化钠溶液（用于pH调节）（见配方）
沉淀液（或母液）（见配方）

设备

文化瓶（IDEA构想，目录号：ART0004104）
注意：这些是定制的3升培养瓶。
轨道震荡器在30°C和37°C
孵化器在20°C（用于结晶板）
超声波浴（室温）
实验室平衡
冷却离心机
过滤系统或注射器
细胞破坏者CSL"一次性"（Constant Systems，Ltd）
ÄKTAFPLC仪器（GE Healthcare，目录号：18190026）或等效物
SDS-PAGE设备
Zetasizer Nano ZS ^TM用于动态光散射分析（Malvern Instruments，型号：ZEN3600）或等效物
BioPhotometer 6131（德国Eppendorf）
NanoDrop ^TM ND-2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：ND-2000）}
奥林巴斯Zoom立体显微镜（Olympus，型号：SZ1145 TR CTV）或等效物
注意：本产品已停产。
奥林巴斯透射灯照明基地（Olympus，型号：SZX-ILLK200）或等效物
注意：本产品已停产。

注意：用于在液氮中操作晶体的晶体析出材料（LN 2/2）

Litholoops几种尺寸（分子尺寸）
CryoCaps（Plain）（分子尺寸，目录号：MD7-400）
磁性CryoVials（分子尺寸，目录号：MD7-402）
EMBL / ESRF样品更换器入门套件（分子尺寸，目录号：MD7-500）
磁性冷冻棒（分子尺寸，目录号：MD7-411）
泡沫杜瓦瓶（分子尺寸，目录号：MD7-35）
干托运人（CX100）杜瓦瓶（分子尺寸，目录号：MD7-21）

程序

MGD1的表达△137-6His蛋白质
这里描述的蛋白质构建是一种截短形式的MGD1（MGD1△137-6His），其蛋白C末端被剥夺了其N-末端136个氨基酸残基和不可裂解的6-组氨酸标签。缺失的片段包含典型的N-末端叶绿体信号肽（重排1-106;在进入细胞器时被切割）和预测为无序的30聚体区，并不是活性所必需的。 DNA片段已被克隆在我的Ide I / 不 I pET29b载体的位点（Novagen，69872），产生pET29b-MGD1△137-6His构建体。 E。大肠杆菌BL21（DE3）细胞用作蛋白质生产的宿主细胞。
1. 准备1L补充有卡那霉素（30μg/ ml）的无菌LB培养基。接受媒体与 E。含有pET29b-MGD1△137-6His构建体的大肠杆菌BL21（DE3）细胞。在37℃和180rpm下孵育培养物。
2. 在UV / VIS分光光度计上监测培养物的OD 600nm。
3. 在OD 600nm〜0.6-0.8，取1ml培养物用于SDS-PAGE分析（诱导前T0）。离心（13,000×g，1分钟），弃去上清并将沉淀重悬于40μl蒸馏水和10μl5×DB中。煮沸样品5分钟，并在凝胶加载之前超声处理2分钟
4. 用IPTG诱导细胞至0.25mM的终浓度。在30℃，180rpm下孵育4小时。
5. 诱导后，取1 ml培养液进行SDS-PAGE分析（诱导后T4）。离心机（13,000×g，1分钟），弃去上清并将沉淀重悬于80μl蒸馏水和20μl5×DB中。煮沸样品5分钟，并在凝胶加载之前超声处理2分钟
6. 通过离心收集细胞（7,000 x g在4℃下20分钟）
7. 丢弃上清液并将颗粒储存在以前称重的50ml科林管中
8. 称重湿细胞沉淀并储存在-20°C，如果不立即使用（通常约4 g / L培养）
IMAC纯化MGD1△137-6His蛋白质

将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（通常为5ml / g细胞）。如果细胞再悬浮是困难的，可以使用高达10ml / g的裂解缓冲液细胞。

加入消泡剂204（1-2滴〜约20毫升）

在1.5-1.8 kbar的细胞破坏系统上破坏细胞，并在冰上孵育裂解液20分钟。如果裂解物在破裂时粘度过大，可加入更多的Benzonase核酸酶和/或在冰上增加孵化时间。

在4℃下以45,000×g旋转裂解物30分钟。恢复上清液，在结合/洗涤缓冲液中稀释2x，并通过使用0.2μm过滤器过滤进一步澄清

用5-10毫升（柱体积）的结合/洗涤缓冲液，以1毫升/分钟（5毫升柱为2毫升/分钟）平衡1分钟（或5毫升放大）。

在柱中以1ml / min注入澄清的裂解物。收集列流通。

用相同的缓冲液洗涤柱直到Abs <280nm 是稳定的

以5-10毫升8％洗脱缓冲液（40毫摩尔咪唑）洗涤1毫升/分钟（5毫升柱2毫升/分钟），然后加5-10微克16％（80毫摩尔咪唑）相同解。

使用16-100％相同缓冲液（80-500mM咪唑）的线性梯度洗脱1ml / min的洗脱蛋白（5ml柱的2ml / min）。通常，梯度进行10分钟（在5ml柱上15分钟）

在所有纯化步骤中收集级分（1ml）

评估MGD1的蛋白质纯度 / span> 137-6通过SDS-PAGE分析含有级分 - 取16μl样品，加入4μl5x DB。煮沸样品5分钟，并在凝胶加载之前超声处理2分钟

评估MGD1的蛋白质同质性△< / span> 137-6通过动态光散射（DLS）分析包含分数（详见附注7）。

使用Vivaspin 20，MWCO 30,000 Da浓缩器（参见注释8）了解适当的级分并浓缩至20 mg / ml。

在NanoDrop TM 2000分光光度计上使用序列衍生的消光系数为47,900M -1，在280nm下通过紫外吸收来监测蛋白质浓度 sup>。使用1：1洗涤/洗脱缓冲液混合物[（咪唑）最终<250>]作为空白。
大小排除纯化MGD1△137-6His蛋白

将Superdex S200 10/300 GL柱与2 CV（48ml）的排阻缓冲液以0.5-0.8ml / min（控制压力不超过1.5MPa的最大限度，否则减少流量）平衡。 >

在柱中注入最多500μl的20 mg / ml蛋白质样品。

用相同的缓冲液洗涤柱子以洗脱蛋白质。

收集0.5ml级分，并对样品进行SDS-PAGE和DLS分析。对于SDS-PAGE，取16μl样品，加入4μl5x DB。煮沸样品5分钟，并在凝胶加载之前超声处理2分钟。如果样品太粘稠，无法凝胶装载，则会增加煮沸和/或超声时间

用2 CV的Mili-Q（MQ）水洗涤柱子，然后用2 CV的20％乙醇洗涤

含有纯均匀的MGD1△137-6His蛋白的泳池级分。

使用Vivaspin 20，MWCO 30,000浓缩器将蛋白质浓缩至约10mg / ml

使用大小排阻缓冲液作为空白，在280nm处通过紫外吸收来监测蛋白质浓度

准备40μl等分试样并储存于-20°C，直至进一步使用。
结晶MGD1△137-6His蛋白质

准备6毫克/毫升的蛋白质储备溶液（使用大小排阻缓冲液进行稀释）

制备含有200mM MgCl 2·6H 2 O和22％（w / v）PEG 3350的沉淀溶液。

将400μl沉淀剂溶液吸入结晶板的储存器中。

使用1μlMGD1准备结晶滴（1）MGD1 △ 137-6为6 mg / ml和2μl沉淀剂溶液。

将盖板放在井上（面向水箱）并密封。

孵育板在20°C。经常在显微镜下检查板（晶体出现在一周内，但常常在10-12天内变大）。避免温度变化，尽可能使板材保持在20°C

晶体冷冻保护是通过转移到含有27％（w / v）PEG 3350沉淀剂的母液（沉淀剂溶液）的稳定溶液中（ii），然后在相同的冷冻保护剂中快速浸泡补充有30％（w / v）相同沉淀剂的溶液。使用微晶玻璃材料来安装和处理晶体。

闪光冷却并存储在LN <2>中的晶体。

笔记

关于MGD1在半乳糖脂生物合成中的作用的更详细的解释描述于Rocha等人。（2013; 2016）。
所有解决方案必须在使用前进行过滤。用于尺寸排阻色谱的溶液也要脱气
通过监测由AKTA FPLC系统给出的280nm处的吸光度的稳定性，可以调整（缩短或延长）柱洗涤/平衡步骤的长度。
因为MGD1 △ 137-6H具有45kDa的分子量，可以使用10％丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶。
在过程中可以使用DTT，但对于长期存储，TCEP更加稳定和高效
DLS是在各种条件下表征蛋白质的理想技术，并获得关于其在溶液中的状态的信息。它可用于鉴定提供生物相关寡聚结构的条件，确保单分散性和最佳稳定性，最小化聚集，最终是结晶的理想选择。使用Zetasizer Nano ZS ^{TM蛋白质尺寸分析的默认标准操作方案（SOP），修改温度（4°C或20°C）和使用的溶剂类型（<例如}，水+ 5％甘油）以考虑溶液的粘度。自动执行一式三份的测量。如果样品是单分散的，则仅看到一个群体（单峰），而多聚体由多个群体（几个峰）表示;蛋白质直径周围的尺寸分布（峰宽）也应尽可能窄;最后粒径应与蛋白质物质相适应（非常大的直径表示蛋白质聚集）。 MGD1的典型DLS实验及其预期结果可以在Rocha等人中找到。（2013），其中蛋白质生产优化方案首次发布
在整个纯化过程中，根据其纯度（SDS-PAGE）和均匀性（DLS）测定合适的级分。 MGD1 △ 137 -6不是非常纯的或不均匀的部分从合并中丢弃，不用于以下步骤。通常，洗脱色谱峰的开始和结束部分不包括在合并中。
有几个教程可用于显示如何在蒸气扩散技术中结晶蛋白质。这里给出了一些教程的有用链接：

xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html < / a> - Terese Bergfors关于蛋白质结晶的教程
https://www.youtube.com/watch?v=gLsC4wlrR2A < / a> - 了解晶体学，第1部分：从蛋白质到晶体
https://www.youtube.com/watch?v= Grh8-pHpAJ4 - 蛋白质结晶悬滴蒸气扩散

食谱

裂解缓冲液
25 mM HEPES缓冲液
500 mM NaCl
1 M尿素
10 mM咪唑
1 mM DTT
将pH调节至7.5
加入Benzonase（1μl/ 10ml溶液）和cOmplete TM蛋白酶抑制剂混合物（1片/ 50ml溶液）。
洗涤/结合缓冲液
25 mM HEPES
500 mM NaCl
1 M尿素
10 mM咪唑
1 mM DTT
将pH调节至7.5
洗脱缓冲液
25 mM HEPES
500 mM NaCl
1 M尿素
500毫克咪唑
1 mM DTT
将pH调节至7.5
大小排除缓冲区
25mM Bis-Tris丙烷
150 mM NaCl
5％（v / v）甘油 1 mM TCEP
调整至pH 6.5
SDS-PAGE沉积缓冲液（5x DB）
250 mM Tris，pH 6.8
50％（v / v）甘油 10％（v / v）SDS
0.05％（w / v）溴酚蓝
250 mM DTT
20％（v / v）乙醇
6 N盐酸溶液（用于pH调节）
10M氢氧化钠溶液（用于pH调节）
沉淀液（或母液）
200mM MgCl 2·6H 2 O
22％（w / v）PEG 3350

致谢

该协议是Rocha等人，2013年和Rocha等人，2016年所描述的这一协议的延伸。这项工作得到了国民经济发展局（National National de la Recherche）（授予ANR - 10-BLAN-1524，ReGal）和罗纳 - 阿尔卑斯地区（法国）。

参考文献

Botté，C.，Jeanneau，C.，Snajdrova，L.，Bastien，O.，Imberty，A.，Breton，C.and Marechal，E.（2005）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16009708"target ="_ blank">植物叶绿体单糖基二酰基甘油合成酶的分子建模和定点诱变揭示了活性的关键残留物。 > J Biol Chem 280（41）：34691-34701。
Miaege，C.，Maréchal，E.，Shimojima，M.，Awai，K.，Block，MA，Ohta，H.，Takamiya，K.，Douce，R.and Joyard，J。（1999） a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10518794"target ="_ blank"> A型MGDG合酶的生化和拓扑性质，菠菜叶绿体包膜酶催化原核和真核MGDG的合成。 Eur J Biochem 265（3）：990-1001。
Nishiyama，Y.，Hardré-Liénard，H.，Miras，S.，Miège，C.，Block，MA，Revah，F.，Joyard，J.and Marechal，E。（2003）。从变性包涵体折叠，纯化至同质性，并简化了来自陆地植物的MGDG合酶测定。蛋白质清除31（1）：79-87。
Rocha，J.，Audry，M.，Pesce，G.，Chazalet，V.，Block，MA，Maréchal，E.and Breton，C。（2013）。重新拟南芥中主要的半乳糖脂肪酸合成酶MGD1的表达和纯化，以建立生化和结构研究的新标准。 Biochimie 95（4）：700-708。
Rocha，J.，Sarkis，J.，Thomas，A.，Pitou，L.，Radzimanowski，J.，Audry，M.，Chazalet，V.，de Sanctis，D.，Palcic，MM，Block，MA，Girard -Egrot，A.，Marechal，E.和Breton，C。（2016）。＆nbsp; MGD1（植物中主要的半乳糖脂合成酶）的结构见解和膜结合特性。植物J 85（5）：622-633。