材料和试剂

200μlPCR管
1.5 ml Eppendorf管
10或100μl移液器吸头
能力 E。大肠杆菌细胞（没有特别的偏好，但应该是重组缺陷型）
模块gRNA质粒（可从Addgene获得，参见表1中相应的Addgene质粒ID）
将pFUS-B1至pFUS-B10，pFUS-A，pFUS-A30A和pFUS-A30B质粒（得自Addgene，Golden Gate TALEN和TAL Effector Kit 2.0）（Addgene，目录号：1000000024）
NEB缓冲液2（New England BioLabs，目录号：B7002S）
I（FastDigest）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：FD1014）
T4 DNA连接酶（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：EL0014）
蒸馏的H 2 O 2 /
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A1593）
LB培养基
dNTP
DreamTaq或其它等同的DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：K1072）
琼脂糖
质粒制备小试剂盒（不特别优选，我们使用来自MACHEREY-NAGEL的Nucleo Spin质粒easy纯试剂盒，目录号：740727）
我（BpiI）（FastDigest）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：FD0293）
质粒安全ATP依赖性DNA酶（Epicentre，目录号：E3101K，ATP包含在该试剂盒中）
壮观霉素（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1441）
X-gal（Sigma-Aldrich，目录号：B4252）
IPTG（溶解于水中的IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
I（BspTI）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：FD0834）
I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：FD0684）
（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：FD0454）的 Bsm I（Esp3I）
用于PCR筛选的通用引物（参见表1）

表1.质粒和引物为此方案开发的质粒可从Addgene获得，具有相应的Addgene ID。用于将gRNA寡核苷酸克隆到单个gRNA表达质粒中的单模块质粒（pMA-SpCas9-g1至pMA-SpCas9-10）。用于装配含有11-30个gRNA表达盒的gRNA表达阵列的阵列质粒（pMA-MsgRNA-EGFP）。在该方案中用于筛选组装的阵列质粒的引物序列
注意：Universal U6和Scr引物已修改，以适应此协议中的PCR条件。

设备

加热块（Grant Instruments，型号：QBD2）
微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424）
37℃热孵育器（Labnet International，型号：211DS）
37℃振荡培养箱（环境培养箱摇床G24）（Eppendorf，New Brunswick Scientific，型号：G24）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ，型号：Veriti 96孔热循环仪）
DNA电泳仪（Bio-Rad Laboratories，型号：Wide mini-sub cell GT）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，型号：Nanodrop 1000分光光度计）

程序

准备：设计和订购CRISPR gRNA oligos
1. 使用任何在线设计工具（如优化的CRISPR设计工具）设计靶gRNA寡核苷酸（ http： //crispr.mit.edu/）。
  注意：
2. 对于以"G"开始的靶位点，将以下四个核苷酸突出端添加到有义（SS）和反义（AS）gRNA寡核苷酸：
  SS：5'CACC（N ）
  AS：5'AAAC（N ）
3. 对于没有用"G"表示的目标站点，请添加以下悬挂：
  SS：5'CACCG（N ）
  AS：5'AAAC（N ）C
4. 从任何合格的公司订购寡核苷酸，稀释寡核苷酸到库存浓度为100 pmol /μl（μM），并存储在-20°C。（寡核苷酸的标准脱盐纯化是足够的）。
gRNA寡聚物的退火
1. 退火每个gRNA的有义和反义gRNA寡核苷酸在单独的1.5毫升EP管：
  检测gRNA寡核苷酸：1μl（100pmol /μl）
  反义gRNA寡核苷酸：1μl（100pmol /μl）
  10×NEB缓冲液2：2μl
  加入ddH 2 O至最终体积为20μl。
2. 在95℃下在加热块中将混合物变性5分钟
3. 将加热块放在实验台上，缓慢退火寡核苷酸，直到混合物处于室温（约需1-2小时）
4. 将退火的gRNA寡核苷酸快速离心至管的底部并储存在-20℃以备以后使用或进行以下实验步骤。
矢量克隆
使用该方案，在5天（对于1至10gRNA表达盒）至7天（对于11至30盒）完成gRNA表达阵列载体的产生。有关概述，请参见图2中的原理图。在协议中，CRISPR表达阵列中靶位点的位置称为T＃（＃，表示gRNA的顺序的1至30之间的整数）。该方案利用10个单独的gRNA表达盒，其依赖于盒的数目串联组装成一组"阵列"载体，其中每个阵列载体含有多达10个盒。当组装11-30个盒时，多个阵列向量最终组装成单个向量。用于组装的质粒的选择在步骤C3c，表3中描述。图1中给出了示意图

图2.协议概述。协议的日常概述。对于组装1至10μgRNA表达盒，在第5天的阳性菌落的小量制备后完成方案。对于装配11至30gRNA表达盒，在第5天进行另一轮组装，并在第7天后完成。 >
1. 第1天。将gRNA寡核苷酸连接到单个模块化单gRNA表达载体中
2. 第2天。菌落筛选和培养
  1. 使用10或100μl移液器吸头从每次转化中选择两到三个菌落
  2. 将移液器吸头在100μlLB培养基（50μg/ml氨苄青霉素）中开始初始培养。将移液器吸头转移到含有30μl不含核酸酶的水的PCR管中，上下移液管释放细胞。
    注意：初始培养和PCR管应该用相同的ID标记。如果使用超过10 gRNA，我们通常使用两套200μlPCR管，一套用于初始培养，另一套用于细胞裂解液。
  3. 将初始培养管置于37℃培养箱中
  4. 将PCR管置于98℃的热循环仪中10分钟以裂解细胞
  5. 进行细胞裂解物的gRNA PCR筛选。添加到每个反应：
    1. 1μl转化的大肠杆菌裂解物
    2. 5 pmol通用U6正向引物（表1）
    3. 5pmol所讨论的gRNA的反义寡核苷酸
    4. 0.4μldNTP（10mM）
    5. 0.1μlDreamTaq聚合酶（或类似物）
    6. 2μl10x DreamTaq缓冲液（最终浓度为1x）
    7. 无核酸酶水至20μl总反应体积。
    实施例：对于pMA-SpCas9-T1的菌落筛选，使用通用U6启动子作为正向引物和T1反义寡核苷酸作为反向引物对2-3个挑选的菌落进行PCR。
  6. 在热循环仪中用以下条件孵育PCR反应物：
  7. 通过电泳在1％琼脂糖凝胶上显现PCR产物。预期的扩增子大小约为270bp
  8. 从每个转化中选择一个阳性菌落，并将50μl初始培养物转移到含有5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的单个管中。
  9. 在37℃在轨道摇床中孵育过夜。
3. 第3天。质粒制备和单个gRNA表达盒装配到'阵列'质粒
  1. 使用商业小量制备试剂盒根据制造商的说明书从过夜培养物中分离质粒DNA（命名为pMA-T＃）。
  2. 使用通用U6引物（推荐）通过Sanger测序验证单个gRNA表达质粒。
  3. 根据表3选择用于单个gRNA表达质粒的1种组装的阵列质粒：
    
    表3.选择用于装配pMA-T＃载体的阵列质粒。阵列质粒的选择取决于待装配的gRNA表达盒的数量。对于1-10μgRNA盒的装配（左），根据gRNA盒的数目选择pFUS-B＃阵列质粒之一。当装配11-20μgRNA盒（中间）时，选择pFUS-A用于装配gRNA盒1至10.对于剩余的盒（≤10），根据数目选择一个pFUS-B＃阵列质粒gRNA盒。对于21-30gRNA盒的装配（右），pFUS-A30A用于装配前10个gRNA表达盒。 pFUS-A30B用于装配gRNA盒11至20.根据gRNA盒的数目将剩余的盒（≤10）克隆到pFUS-B＃阵列质粒中。
  4. 在单独的PCR管中设置金门装配反应，包含：
    1. 30 ng阵列质粒注意：质粒数量已优化。
    2. 50ng各个单独的模块化单gRNA质粒（最多10个质粒）
    3. 1μl Bsa I限制酶
    4. 1μlT4 DNA连接酶
    5. 2μl10×T4连接酶缓冲液（最终浓度为1x）
    6. 无核酸酶水至20μl总反应体积。
  5. 在以下条件下在热循环仪中孵育反应：
  6. 加入1μl25 mM ATP和1μl质粒安全DNase进行反应注意：质粒安全DNase处理消化所有未连接的线性dsDNA片段，不完整的装配产物和线性化载体。该步骤使感受态细胞中线性化dsDNA片段的体内重组的风险最小化。当组装五个以上的gRNA表达盒时，这一步骤是非常重要的。
  7. 在37℃下，在热循环仪中孵育反应1小时
  8. 转化能力。大肠杆菌细胞，使用2μl组装产物
  9. 在含有50μg/ml壮观霉素以及8μl100mg /μlX-gal和8μl0.5M IPTG的10cm LB琼脂平板上转化细胞（1/20），用于蓝色/白色菌落筛选。 >
  10. 在37℃下孵育琼脂板过夜。
4. 第4天。
  
  菌落筛选和培养
5. 第5天。用于含有11至30个表达盒的质粒的质粒DNA制备和2
6. 第6天。3 菌落筛选和培养
  1. 检查板为阳性白色菌落。白色与蓝色菌落的预期比率为> 80％，以便成功组装
  2. 按第2天所述选择2至3个白色菌落。
  3. 为所有挑选的菌落的gRNA表达盒的每个组装部分设置重叠PCR筛选反应。对于个别PCR管，添加：
    1. 1μl转化的E。大肠杆菌裂解物
    2. 5pmol作为正向引物的第一或第二表达盒阵列中最后一个gRNA（T10或T20）的正义寡核苷酸。
    3. 5 pmol第二或第三表达盒阵列中第一gRNA（T11或T21）的反义寡核苷酸作为反向引物。
    4. 0.4μldNTP
    5. 0.1μlDreamTaq聚合酶（或类似物）
    6. 2μl10x DreamTaq缓冲液（最终浓度为1x）。
    7. 无核酸酶水至20μl总反应体积。
    实施例：为了验证组装的pMsgRNA-EGFP-M30（含有从pFUS-A30A-pFUS-A30B-pFUS-B10的装配产生的30μgRNA表达盒的阵列质粒），进行两个单独的重叠PCR反应。第一反应使用T10的有义（SS）寡核苷酸作为正向引物，使用T11的反义（AS）寡核苷酸作为反向引物。第二种使用T20的SS寡核苷酸作为正向引物和T21的AS寡核苷酸（图5）。
  4. 在热循环仪中用以下条件孵育PCR反应物：
  5. 通过电泳在1％琼脂糖凝胶上显现PCR产物。预期的扩增子大小约为460bp
  6. （可选）对所有邻近的gRNA执行重叠PCR
    
    图5.重叠PCR筛选：上图：pMsgRNA-EGFP-M30的重叠PCR筛选的示意图。底部：在1％琼脂糖凝胶上显现的pMsgRNA-EGFP-M30的指导特异性PCR验证的实例。泳道10和泳道20含有上述重叠PCR反应。注意，重叠PCR产生比引物特异性PCR稍大的条带。强烈建议生成理论质粒序列图作为装配，PCR验证和限制性酶消化的指南
  7. （可选）使用T＃作为引物的Sanger测序。
  8. 选择一个阳性菌落并将50μl初始培养物转移到含有5ml添加有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基的各管中。
  9. 在37℃在轨道摇床中孵育过夜
7. 第7天。质粒DNA的制备和验证

笔记

为了在每个装配反应中克隆的效率，对于单个gRNA表达载体，我们通常经历高于95％的阳性率。该阳性率基于PCR筛选。 gRNA表达阵列的装配的阳性率基于白色（阳性）与蓝色（阴性）菌落的比率。请注意，所有蓝色菌落都是阴性。然而，如果白色菌落含有不正确的连接或重组产物，则它们也可以是阴性的。因此，进行PCR筛选是重要的。
如果观察到高的蓝色菌落率，建议检查酶的有效期，因为FastDigest酶具有相对短的储存时间。其他措施如降低装配反应中pFUS质粒的量，增加循环数，增加酶的量可以提高白色菌落率。

致谢

JVN和ALN得到Lundbeck基金会，Krista Og Viggo Petersens Fond，Fabrikant Einar Willumsens Mindelegat和FondenLægevidenskabensFremme的资助。 LL和LB由Lundbeck基金会的DREAM项目提供支持。 YL由丹麦独立研究研究委员会，Sapere Aude Young研究人才奖YL，Lundbeck基金会和丹麦创新基金（BrainStem）资助。该方案是基于我们先前发表在"细胞分子生命科学"（Vad-Nielsen等人，2016）中的研究而开发的。我们还认可Voytas DF的研究小组，他们为本方案中使用的第一个装配构建了质粒（Cermak等人，2011）。

参考文献

Cermak，T.，Doyle，EL，Christian，M.，Wang，L.，Zhang，Y.，Schmidt，C.，Baller，JA，Somia，NV，Bogdanove，AJand Voytas，DF（2011）高效设计和装配定制TALEN和其他基于TAL效应的构建体用于DNA靶向。核酸研究 39（12）：e82。
Vad-Nielsen，J.，Lin，L.，Bolund，L.，Nielsen，AL和Luo，Y。（2016）。用于同时靶向多个基因的CRISPR gRNA表达阵列的金门装配 Cell Mol Life Sci 73 ：4315-4325。