材料和试剂

24孔板（VWR，目录号：391-3370）
Minisart过滤器0.45μm孔径（Sartorius，目录号：16537）
6孔板（VWR，目录号：700-1425）
8室玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：177402）
显微镜盖玻片（MEDI PLAST FENNO，目录号：702-1051204）
吸头提示
500 ml瓶
用于293ft细胞的超贴壁细胞培养板

Nunclon表面10cm（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：150350）
Nunclon表面6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：145380）

293ft细胞（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：R70007）}
MCF10A细胞（ATCC，目录号：CRL-10317 ^TM）
MCF10A-MycER细胞（Nieminen等人，2007）
质粒和载体：

pCMV-dR8.91（Delta 8.9）包装质粒（Marques等人，2016）
pCMV-VSVg包膜构建体（Marques等人，2016）
pDSL_UGIH慢病毒shRNA载体（Alliance for Cellular Signaling）（Marques等人，2016）
pLKO慢病毒载体（Broad Institute TRC library，MISSION TRC-Hs 1.0 library）（Sigma-Aldrich）（Marques等人，2016）
基于pGIPZ mir-30的载体（Open Biosystems）（Marques等人，2016）
非靶向shRNA对照构建体（在pDSL_UGIH，pLKO.1和pGIPZ慢病毒骨架中）（Marques等人，2016）
修饰的入门载体pENTR-H1（Nieminen等人，2007; Marques等人，2016）

细胞培养和转染

Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21041-025）
乳房上皮基础培养基（MCDB 170）（BioConcept AG Costumer基于USB粉末制剂制备的产品[Labome，目录号：M2162]，不含L-谷氨酰胺;目录号：9-02S77-I）
转染试剂 - jetPEI（Polyplus，目录号：101-01N）

DMEM培养基补充剂（在使用前添加;参见食谱）：

粪便小牛血清（FCS）（Biowest，目录号：S1810-500）
L-谷氨酰胺（Lanza，目录号：17-605E）
青霉素 - 链霉素（Lanza，目录号：17-602E）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）（Bionordika，目录号：17-516F/12）
聚凝胺（Sigma-Aldrich，目录号：H9268）
Matrigel ^®（Coring，目录号：356230）
RNeasy Mini Kit（Qiagen，目录号：74104）
ELB裂解缓冲液试剂（见配方）

HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H-3375）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Nonidet P40替代品（NP-40）（Sigma-Aldrich，目录号：74385）

蛋白酶抑制剂鸡尾酒

Complete Mini（Roche Diagnostics，目录号：04693159001）
PhosphoStop（Roche Diagnostics，目录号：04906837001）

0.05％胰蛋白酶（从5％胰蛋白酶-EDTA [10x]稀释）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15400-054）}
4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液储备溶液（PFA）（以粉末：Sigma-Aldrich，目录号：16005-1Kg-R或20％水溶液Electron Microscopy Sciences，目录号：15713-S使用）
Triton X-100，在PBS中使用0.25％稀释（Sigma-Aldrich，目录号：9002-93-1）
阻止解决方案（参见配方）
免疫荧光（IF）缓冲液试剂（见配方）

叠氮化钠（NaN 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S-2002）
牛血清白蛋白（BSA）（Biowest，目录号：P6154）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）

以10％浓度使用的正常山羊血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：PCN5000）
复染和抗体：

Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，目录号：861405）注意：此产品已经停产，并已被bisBenzimide H 33258（Sigma-Aldrich，目录号：B2883）取代
β-连环蛋白（BD，目录号：610153）
GM-130（BD，目录号：610823）
抗CD49f /α6-整联蛋白（EMD Millipore，目录号：CBL458）
E-钙粘蛋白（BD，目录号：610182）
Ki-67（Leica Biosystems，目录号：NCL-Ki67p）
活性半胱天冬酶-3（Cell Signaling Technology，目录号：9661L）
ZO-1（Abcam，目录号：ab59720）
Desmoplakin I + II（Abcam，目录号：ab16434或ab71690）
Desmoglein 2（Abcam，目录号：ab14415）

Power SYBR Green Cells-to-CT Kit（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：4402953）
Immu-Mount TM试剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：9990412）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434-5KG-R）
MCDB 170培养基补充剂（在使用前添加;查看食谱）：

当不可获得时，使用来自Upstate（Sigma-Aldrich，目录号：02-104）的BPE（150mg /批），牛垂体提取物（BPE）（Sigma-Aldrich，目录号：P-1476）
上皮生长因子（EGF）（Sigma-Aldrich，目录号：E-9644）
转铁蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T-2252）
异丙肾上腺素（Sigma-Aldrich，目录号：I-5627）
氢化可的松（Sigma-Aldrich，目录号：H-4001）
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I-9278）
两性霉素B（Sigma-Aldrich，目录号：A-2942）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G-1397）

100nM 4-羟基他莫昔芬用于活化MycER TM sup构建体（4-OHT;从1mM储备液稀释）（Sigma-Aldrich，目录号：H7904）
SuperScript Vilo cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：11754-050）

设备

37℃，5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific Inc.，型号：Forma TM supra系列II 3110）中， >
Shaker（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4625Q）
共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss，型号：配备有氩气[548]，氦 - 氖[543和633]和二极管[405]激光器和Plan-Neofluar 40x DIC物镜[NA = 1.3，油]的LSM Meta 510和780）
装备有Apotome系统（Zeiss）和20x平面消色差物镜（NA = 0.8，空气），MRr数码相机和Axiovision 4.4软件的Zeiss Axio vert 200显微镜。
Light Cycler 480 II仪器（Roche Diagnostics，型号：Light Cycler 480 II）
Nanodrop（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：NanoDrop 8000）
具有Swing Swing-out转子4位置（DJB Labcare，目录号：75006445）的Heraeus Multifuge 3SR Plus（DJB Labcare，目录号：75004371）和用于4个微量滴定板（DJB Labcare，目录号：75006449）的Microtitre载体

软件

ImageJ软件（国立卫生研究院，版本1.50i）

程序

构建shRNA文库以靶向推定的人上皮完整性调节基因（hEIR）

设计shRNA以靶向每个hEIR基因的第一和/或最长ENSEMBL转录物，并且每个转录物选择1-3个shRNA靶序列。
总共，将对应于选择的最佳靶序列（每个基因1-3个）的136个shRNA寡核苷酸首先克隆到pENTR克隆载体中，然后克隆到pDSL_UGIH慢病毒shRNA载体。另外，获得pLKO慢病毒载体中的40个shRNA和基于pGIPZ mir-30的载体中的43个shRNA，以完全覆盖先前选择的靶基因。关于设计用于靶向上皮完整性调节基因的shRNA文库的进一步信息可以在Marques等人中找到。（2016）。

慢病毒颗粒的生产

将慢病毒载体转染到在超粘附24孔板中生长的293ft细胞。在转染前一天接种每孔1ml DMEM中的200,000个细胞。详情如下：

慢病毒载体混合物：选择的转移质粒（shRNA表达载体）：将Delta 8.9（包装）：pCMV-VSVg（包膜）以4:3:2（总重量10μg;4.44μg，3.33μg， 2.22μg）的25μl150mM NaCl中，并在室温下温育5分钟。
转染：将1μlJetPEI与25μl150mM NaCl混合，并在室温下温育5分钟。将慢病毒载体混合物和转染试剂JetPEI混合并在室温下孵育20分钟，并滴加到细胞中。转染时的培养基体积为0.5ml

将转染的细胞在37℃/5％CO 2下孵育至少4小时，然后每孔加入0.5ml新鲜培养基，使总体积为1ml。
培养72小时后，通过0.45μm过滤器过滤培养基收集病毒。
偶尔在6孔板中产生病毒，使用以下公式：293ft 1百万个细胞，100μl的150mM NaCl和6μl的JetPEI。

MCF10A细胞慢病毒感染

将MCF10A细胞接种在6孔板中，目标是用2ml MCDB170 +补充培养基进行50-60％汇合（3-4×10 5个细胞/孔）。
第二天，更换培养基并用PBS洗涤细胞。然后将中和新鲜收获的病毒以1:1的比例加入细胞（在6孔板形式中，将500μl病毒悬浮液加入500μl培养基中）。
聚凝胺以1：1,000（8μg/μl）的比例加入到细胞中
在37℃下将细胞与病毒和聚凝胺孵育10分钟后，将板在室温下以770×g离心30分钟以进行病毒转导改善。
将细胞进一步温育至少4小时，然后用2ml新鲜培养基替换含有病毒颗粒的培养基。

用于测定的细胞收集
感染后72小时将MCF10A细胞裂解用于RT-qPCR和/或Western印迹分析以敲低效率分析或接种到用于3D培养测定的Matrigel 中。
shRNA敲低验证

RT-qPCR：使用RNeasy试剂盒中提供的缓冲液裂解细胞，随后使用试剂盒缓冲液和说明书进行RNA分离。
蛋白质印迹：将细胞在补充有蛋白酶抑制剂（1/2片剂[Complete Mini和PhosphoStop]/10ml缓冲液）的40μlELB裂解缓冲液中裂解。

为shRNA转导的MCF10A细胞设置3D培养物

Matrigel 应在4℃冰上解冻过夜。
8小室玻片，移液管和移液管吸头应在开始实验前在4°C预冷至少1小时。
每个室在4℃下用31μl的基质胶包被。 Matrigel应以同心方式应用，避免与室壁接触和气泡的形成。
将基质胶包被的载玻片在37℃下孵育20-30分钟以固化基质胶。
当基质胶固化时，shRNA转导的MCF10A生长的细胞应当被胰蛋白酶消化，计数并评价其存活力。每个室在基质胶的顶部接种1,500个活细胞。根据悬浮液中活细胞的原始浓度，细胞可以在20μl至400μl培养基中稀释。
通过小心地吸取旧培养基并将400μl新培养基吸入各个室中，培养基应每三天更新至3D培养物。

固定3D培养细胞

除去培养基，用400μlPBS洗涤细胞两次
使用200μl的2％PFA在室温下固定细胞20分钟
固定后，在室温下用400μlPBS洗涤细胞两次
如果3D培养物在同一天没有免疫染色，细胞可以储存几天（建议的最大时间是一周）。这应该在4°C进行，保持细胞在最后一次PBS清洗和使用8室幻灯片盖，以避免样品脱水。

3D培养物的免疫染色

3D培养物在室中使用200μl的0.25％Triton X-100在PBS中在室中透化10分钟。
渗透的3D培养物在室温下与200μl封闭溶液（具有10％正常山羊血清的免疫荧光[IF]缓冲液）温育1-1.5小时。
将一抗在封闭溶液中稀释，并以150μl体积加入每个3D培养室中（抗体浓度范围为1:50至1:500，更多信息参见说明）。
使用8室玻片盖在4℃下将一级抗体温育过夜。
在室温下用400μlIF缓冲液洗涤细胞三次。每次洗涤以中等速度在摇床中进行20分钟。
之后，将3D培养物中的细胞在室温下在150μl在封闭溶液中稀释的合适的Alexa Fluor二抗（在浓度范围从1：150至1：1,000，参见注释获得进一步信息）中温育45分钟。
3D培养物随后在室温下用400μlIF缓冲液洗涤两次
将核用150μlHoechst 33258（在PBS中1:10,000）复染色15分钟，并在室温下用400μlIF缓冲液再洗涤一次。
免疫染色后，通过小心地移除腔室和胶水，保持它们附着到显微镜载玻片上来安装3D培养物。盖玻片安装有几滴Immu-Mount试剂。

3D文化的成像

在3D文化发展期间（建议每隔一天）应用光学显微镜监测MCF10A结构的形成。
形态测量分析的图像用倒置落射荧光显微镜，配备有配备20x Plan物镜（图2）的apotome系统获得。
应使用共聚焦显微镜用更高分辨率的成像研究细胞反应（例如，Ki67，活性半胱天冬酶3）和上皮完整性标记（例如，α6-整联蛋白，GM130，桥粒核心糖蛋白，桥粒蛋白ZO-1）。对于进一步的高分辨率形态学研究和3D重建，Z叠加可以从MCF10A结构获取并组装成视频和3D解卷积（视频1和2）。

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视频1.腺泡结构Z形堆栈（从上到下）的动画可视化。在本实施例中，MCF10A腺泡结构在敲除DVL3基因后生长10天。染色为E-钙粘蛋白的红色和细胞核的蓝色。

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视频2.从之前显示的Z-stack的3D结构重建

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图像分析

使用ImageJ软件打开图像进行形态测定分析。
使用软件图像菜单将图像转换为16位类型。
图像阈值应手动调整（图像菜单，调整子菜单）。阈值协议允许增强二进制对比度以更好地可视化用于计算量化的结构的边界。对原始和阈值图像的可视并排检查对于验证处理图像的真实性质是必不可少的（图2）。
如果阈值处理过程融合相邻的3D结构，则应当使用Pen工具来分离原始图像中明显是各个形状的形状。
分析图像的形态测量参数面积和圆形度。这些和其他形状描述符可以在分析菜单，设置测量子菜单下找到
每个基因型至少30个结构应分析形状参数（面积和圆形度）。示例数据如图3所示。
不同细胞反应和上皮完整性改变的共聚焦图像分析的方案描述于Marques等人。（2016年）。

代表数据

图2.用于形态测量分析的核染色图像（比例尺=20μm）之前（左）和之后（右）的示例图像

图3.在这组实验中，shRNA3（紫色; PARD6B shRNA）诱导了3D腺泡结构的面积和圆形度的轻微改变。相比之下，shRNA1（红色; PARD6G shRNA）和shRNA2（绿色; DVL3 shRNA）减少圆形（对称性）和增加面积（大小）的3D腺泡结构。因此，DVL3和PARD6G，但不是PARD6B似乎对于正确的上皮完整性的发展是重要的。

数据分析

对应于每个构建体的形态测定值是从>分析的最小30个3D MCF10A结构的平均值。 3视野（FOV）。
对照shRNA转导结构的形态平均值设置为1，并且表型数据可以作为相对于对照的倍数变化来分析。
选择的阈值设定为上皮结构面积的20％倍变化， 10％对称。有关数据分析的更多详情，请参阅Marques 。（2016）。
基于阈值，根据大小和对称性的变化（例如，大/增生，小&不对称，等）将shRNA引起的表型分组。筛选和shRNA诱导的表型的结果描述于Marques等人。（2016年）。

笔记

一个重要的方法问题是基质胶批次之间的变异性。不同批次可具有显着不同的生物活性，影响成活的可行性，形态和时间（细胞周期停滞）。实验室使用基于matrigel的3D文化应该有一个内部质量控制系统，严格测试每个新的批次为3D结构增长支持生物活性的不同细胞系使用。
初级和二级抗体浓度需要在初步实验中测试。协议中提供的比率仅为指导原则。

食谱

每500 ml瓶子添加MCDB170补充剂。
2.5ml来自原液的BPE（200x原液 - 14mg/ml;终浓度为70μg/ml） 25μl来自库存的EGF（终浓度为5ng/ml）
250μl来自储备液的转铁蛋白（10mg/ml 2,000x储液;最终浓度5μg/ml）
1ml来自储备的异丙基肾上腺素（500×储备液;终浓度为10μM） 250μl来自储备液的氢化可的松（2,000x储备液;终浓度为0.5μg/ml）
250μl来自库存的胰岛素（2,000x储备液;终浓度5μg/ml）
5ml来自储备液的两性霉素B（50μg/ml）
500μl来自原液（50μg/ml）的庆大霉素
DMEM补充剂添加到500 ml瓶
10％FCS（50 ml，从库存）
来自2mM原液的2.5ml L-谷氨酰胺
1％青霉素 - 链霉素（5ml，来自库存）
ELB裂解缓冲液
150mM NaCl 50mM HEPES，pH7.4 5 mM EDTA
1％NP-40
免疫荧光（IF）缓冲液
7.7 mM NaN 3
中
封锁解决方案
10％山羊血清在IF缓冲液中

致谢

我们要感谢所有Klefström实验室成员为所有的关键建议和输入在开发这个协议。特别感谢实验室成员Johanna Englund，Topi Tervonen，AnneMakelä和Minna Ahvenainen设置了这里描述的许多方法，Tiina Raatikainen和TarjaVälimäki的技术援助和Eric Coles的批评性评论和语言准确性。生物医学成像单元和生物医学功能基因组单元被承认用于核心服务和技术支持。 MCF10A 3D培养物的原始方案描述于Debnath等人的中。（2002）。修改这些方案以进一步扩展遗传方法（Partanen等人，2007; Marques等人，2016）。在MCF10A 3D培养物中鉴定上皮调节基因的shRNA筛选已经在Marques等人中公开。（2016年）。这项研究由芬兰科学院，TEKES，芬兰癌症组织，赫尔辛基生物技术和分子生物学研究生课程和创新药物倡议联合承诺根据授权协议第115188号资助。

参考文献

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Debnath，J.，Mills，KR，Collins，NL，Reginato，MJ，Muthuswamy，SK和Brugge，JS（2002）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/12372298"target ="_ blank">细胞凋亡在正常和癌基因表达的乳腺腺泡内产生和维持管腔空间的作用细胞111（1 ）：29-40。
Marck，E.，Englund，JI，Tervonen，TA，Virkunen，E.，Laakso，M.，Myllynen，M.，Makela，A.，Ahvenainen，M.，Lepikhova，T.，Monni，O.，Hautaniemi， S.和Klefstrom，J.（2016）。 Par6G抑制细胞增殖并且被多种癌症中的功能缺失突变所靶向。致癌基因35（11）：1386-1398。
Nieminen，AI，JI Partanen，A.Hau和J. Klefstrom（2007）。 c-Myc引发的线粒体决定细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡的敏感性。 EMBO J 26（4）：1055-1067。

Partanen，JI，Nieminen，AI，Makela，TP and Klefstrom，J。（2007）。通过LKB1控制的上皮组织抑制c-Myc的致癌性质。 Proc Natl Acad Sci USA 104（37）：14694-14699。 />

Partialen，JI，Tervonen，TA和Klefstrom，J.（2013）。在癌症中破坏上皮极性屏障：LKB1/PAR-4的奇怪病例。 Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 368（1629）：20130111.

Rejon，C.，Al-Masri，M.和McCaffrey，L.（2016）。乳腺癌进展中的细胞极性蛋白。 J Cell Biochem 。

Roignot，J.，Peng，X.和Mostov，K.（2013）。极性在哺乳动物上皮形态发生。 Cold Spring Harb Perspect Biol 5（2）

Shamir，ER和Ewald，AJ（2014）。三 - 三维器官培养：哺乳动物生物学和疾病的实验模型。 Nat Rev Mol Cell Biol 15（10）：647-664。