材料和试剂

1.5 ml管
Greiner Petri dish（60×15mm）（Greiner Bio One，目录号：628161）
牙签
L4幼虫
C。 elegans 菌株（野生型[N2]和粉色-1 [tm1779] ）
大肠杆菌 OP50菌株（获自Caenorhabditis Genetics Center）
液氮
冻干的ATP（与ATP生物发光测定试剂盒CLS II一起提供）（Roche Diagnostics，目录号：11699695001）
蒸馏水
PierceBCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：23225）
胶水
70％EtOH
ATP生物发光测定试剂盒CLS II（Roche Diagnostics，目录号：11699695001）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：1064041000）
Bacto ^{TM胨蛋白胨（BD，目录号：211677）}
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S-6501）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05040）
胆固醇储备溶液（SERVA电泳，目录号：17101.01）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C-5080）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M-7506）
制霉菌素储备液（Sigma-Aldrich，目录号：N-3503）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：1048731000）
（EMD Millipore，目录号：1065860500）
K _{2 HPO ₄}
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P-5405）
磷酸盐缓冲液（1M;无菌，参见配方）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（见Recipes）
M9缓冲区（请参阅配方）

设备

解剖立体显微镜（Olympus，型号：SMZ645）
稳定温度的培养箱（AQUA LYTIC培养箱20°C）
TD-20/20发光计（Turner Designs，型号：2020-000）
台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
冷冻机（西门子，-20℃; So-Low环境设备，型号：So-Low Ultra C85-22水平-80℃冷冻机）
加热板
火锅

软件

Microsoft Office 2011 Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）

程序

同步线虫群体的制备
1. 通过使用解剖立体显微镜选择每个菌株的L4幼虫。将4-6LL幼虫放在新鲜大肠杆菌（OP50）接种的NGM板上（图1A-1C）。每种线虫菌株至少使用三块板。
  
  图1. 秀丽隐杆线虫。 A. 大肠杆菌（OP50）在解剖立体显微镜的基部上接种NGM平板。细菌草坪在琼脂的表面上可见。 B.C的混合群体。通过解剖立体显微镜观察的线虫线虫。线虫在板表面上留下轨迹，指示它们在细菌草坪上的移动。比例尺= 1mm。 C.在发育期间，蠕虫在四个幼虫阶段（L1，L2，L3和L4）中的尺寸增加。 L4雌雄同体线虫可以通过发育的外阴（红色箭头）区分，其是在腹侧中心的清楚的半圆。比例尺= 0.5mm。
2. 在标准温度20℃下孵育线虫。
3. 四天后，盘子含有混合动物种群
4. 通过在解剖立体显微镜下挑取每个菌株的L4幼虫来同步线虫，并将它们转移到分离的新鲜E上。大肠杆菌（OP50）接种板（图1A-1C）
5. 每板添加20-25LL幼虫。对于每个实验条件，至少使用五块板
线虫样品的制备
1. 使用眉毛/睫毛的头发，并收集50-100成年动物在50微升的M9缓冲液在1.5毫升管（见注1）。
2. 在样品制备过程中使用相同数量的每种菌株的动物
3. 在液氮中冷冻样品。
4. 将样品储存在-80°C直到进一步分析
5. 将冻虫浸泡在沸水中15分钟。
6. 将样品在冰上放置5分钟
7. 在4℃下将样品在14,800×g下旋转10分钟。
8. 将样品上清液转移到新的1.5 ml试管中
9. 在测量前加入水稀释样品上清液十倍
10. 将样品保存在冰上或储存在-20°C
工作溶液（ATP标准品和萤光素酶试剂）的制备
1. ATP标准品
  1. 通过添加适当体积的蒸馏水溶解冻干的ATP，使最终浓度为10 mg/ml或16.5 mM（参见注释2）。
  2. 将ATP标准溶液储存在-20°C。 ATP标准溶液至少稳定一周。
  3. 通过在10至1×10 4 -p μM范围内的系列稀释稀释ATP标准品。使用蒸馏水制备一个ATP标准溶液的系列稀释液，以产生ATP标准曲线注意：稀释的ATP标准溶液在4°C下稳定8小时。将其在-20°C下存放更长时间。
2. 萤光素酶试剂
  1. 加入10ml蒸馏水溶解冷冻干燥的荧光素酶
  2. 在4℃下孵育溶解的荧光素酶5分钟
  3. 轻轻旋转瓶子并混合均匀溶液。避免摇晃。
  4. 将萤光素酶试剂储存在-20℃（见注3）
确定ATP水平
1. 添加100微升的每个样品或ATP标准在1.5毫升管。使用含有M9缓冲液的样品作为空白（无ATP）。对于每个样品或ATP标准，至少使用3次重复
2. 向样品/标准品中加入100μl萤光素酶试剂（见注4）
3. 在室温下孵育10秒。
4. 使用TD-20/20光度计测量和记录样品/标准的ATP水平
5. 准备并测量下一个样品/标准品。重复步骤D1-D4。
6. 将每个样品的上清液（溶解的蛋白;在步骤B8期间获得）转移到新的1.5ml管中，并使用标准蛋白试剂盒如Pierce TM BCA蛋白测定试剂盒，根据制造商（图2A）
7. 打开并查看Microsoft Office 2011 Excel中记录的数据（在步骤D4和D6中获得）。
8. 从原始数据中减去ATP空白样品的值。
9. 通过使用ATP标准品的浓度和它们各自的生物发光值制备ATP标准曲线
  
  图2.在C中的ATP水平的细胞内测量。 elegans 。 A.使用BCA蛋白测定法测定牛血清白蛋白（BSA）的典型标准曲线。 B.使用ATP生物发光测定试剂盒CLS II的ATP标准曲线。在TD-20/20发光计中用荧光素酶试剂测定ATP稀释液。 C.在PINK-1耗尽的线虫中ATP水平降低（***
  <0.001;未配对的测试）。误差线表示SEM
10. 通过使用ATP标准曲线数据的对数图来计算每个样品的ATP含量（图2B）
11. 在Microsoft Office 2011 Excel软件中将ATP水平（在步骤D10中获得）与总蛋白量（nM/mg;在步骤D6中获得）分开。
12. 将数据进行进一步和更高级的统计分析（图2C）

数据分析

对于每个菌株或条件，使用至少100只动物，以获得更准确的结果。
对于每个实验，应当对每种菌株和条件检查相同数目的线虫。
每个测定应重复至少三（3）次。
使用学生的 t 测试，其显着性截止水平为 P 0.05用于两组之间的比较。
使用单因素（ANOVA）方差分析，并通过事后Bonferroni检验进行多重比较。

笔记

拿一根牙签，把眉毛/睫毛的头发粘到它的顶端。让它在室温下干燥。然后，使用此工具来选择线虫。在使用眉毛/睫毛之前，始终使用70％的EtOH对其进行消毒
每瓶冻干的ATP含有约10mg（纯度> 98％; Mr：605.2; ATP生物发光测定试剂盒CLS II）。
每个冻/融循环降低荧光素酶活性。因此，a。避免反复冻融; b。准备荧光素酶的等分试样（1ml）; C。在每个冻/融循环后设置一个新的ATP标准曲线。
荧光素酶活性受极端pH值的影响。荧光素酶反应的最佳pH值在7.6-8.0之间

食谱

磷酸盐缓冲液（1M）

对于1L，在蒸馏水中溶解102.2g KH 2 PO 4和57.06g K 2 HPO 4，并且填充高达1 L.这是1M溶液，pH 6.0
高压灭菌并保持室温

线虫生长培养基（NGM）琼脂平板

混合3g NaCl，2.5g Bacto TM蛋白胨，0.2g链霉素，17g琼脂并加入900ml蒸馏水。高压灭菌器
让温度降至55-60°C
加入1ml胆固醇储备溶液，1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4，1ml制霉菌素储备溶液，25ml无菌1M磷酸盐缓冲液，pH 6.0，和蒸馏无菌水至1L
每培养皿倒约8ml培养基，并固化
将板存储在4°C，直到使用

M9缓冲区

在1L蒸馏水中溶解3g KH 2 PO 4，6g Na 2 HPO 4，5g NaCl。高压灭菌器
冷却并加入1ml 1M MgSO 4（无菌）
将M9缓冲液储存在4°C

致谢

这项工作由欧洲研究委员会（ERC），欧洲委员会7 框架计划和博多萨基金会博士后研究奖学金资助。该协议已经改编自Palikaras等人。（2015），Nature 521,525-528。

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