材料和试剂

96孔组织培养板（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229196）
70μl细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）。
50ml锥形管（Denville Scientific，目录号：C1056）
1ml带盖的注射器（BD，目录号：305217）
15ml锥形管（Denville Scientific，目录号：C1018-P）
96孔圆（U）底板（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229190）
C57BL/6小鼠（Taconic Biosciences，目录号：B6-F）
包被抗体：抗小鼠CD28（Affymetrix，eBioscience，目录号：14-0281），抗小鼠CD3e（Affymetrix，eBioscience，目录号：14-0033）
ELISA包被缓冲液（Biolegend，目录号：421701）
EasySep TM缓冲液（STEMCELL Technologies，目录号：20144）或含有含有1mM EDTA的2％胎牛血清（FBS）的PBS
EasySep ^TM小鼠初级CD4 ⁺ T细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19765）
染色抗体：

<抗小鼠CD3-eFlour 450（Affymetrix，eBioscience，目录号：48-0032）
<抗小鼠CD4-Alexa Flour 700（Affymetrix，eBioscience，目录号：56-0041）
<抗小鼠IL-22-APC（Affymetrix，eBioscience，目录号：17-7222）
<抗小鼠IL-17A-PE（Affymetrix，eBioscience，目录号：12-7177）
<抗小鼠CD62L-FITC（Affymetrix，eBioscience，目录号：11-0621）

佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）（Sigma-Aldrich，目录号：79346）
离子霉素（Sigma-Aldrich，目录号：I0634）
使用BD GolgiStop ^TM（BD，目录号：554715）的固定/透化溶液套件
Cytofix/Cytoperm Plus Kit（具有BD GolgiStop ^TM）（BD，目录号：554715）
Iscove's改良的Dulbecco's培养基（IMDM）细胞培养基+ glutamax（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31980-030）}
HyClone TM胎牛血清（美国），表征为FBS（GE Healthcare，目录号：SH30071.03）
HyClone 青霉素 - 链霉素100x溶液（GE Healthcare，目录号：SV30010）
重组猪TGF-β1（R& D Systems，目录号：101-B1）
重组小鼠IL-6（R& D Systems，目录号：406-ML）
重组小鼠IL-23（R& D Systems，目录号：1887-ML）
抗小鼠IFNγγ（R& D Systems，目录号：MAB485）
抗小鼠IL-4（R& D Systems，目录号：MAB404）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Boston BioProduct，目录号：BM220S）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3059）
叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
完成IMDM媒体（请参阅配方）
2x Th17分化条件培养基（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

组织培养箱（NuAire，型号：LabGard Class II type A2）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Sorvall Legend XFR）
BD LSRII流式细胞仪 - BD
科学工业Vortex Genie2（Stellar Scientific，目录号：SI-236）
EasyEight ^TM EasySep ^TM磁铁（STEMCELL Technologies，目录号：18103）

软件

FACS Diva或Flow Jo软件

程序

淋巴细胞分离
1. 在4℃下用50μl抗小鼠CD3（2.5μg/ml）和抗小鼠CD28（2.0μg/ml）在96孔板中涂布所需孔数目过夜。我们使用1x ELISA包被缓冲液进行抗体稀释和包被。我们用1x PBS洗板一次，然后加入细胞。
2. 第二天，安乐死C57BL \ 6小鼠，收获脾脏
3. 将70微米的细胞过滤器放在50ml锥形管上将脾脏放置在细胞滤纸上，并使用1ml注射器盖匀浆/破碎。将注射器盖放置在脾的上部，并用手旋转手柄以压碎/匀化组织。在细胞过滤器中加入1ml EasySep缓冲液以促进匀浆。收集流过（包含细胞），并直接添加9毫升EasySep缓冲液到离心管中。在4℃下离心300×10 10分钟。弃去上清液并用1ml EasySep缓冲液重悬细胞沉淀。计数细胞（不需要RBC裂解步骤），并加入1ml EasySep缓冲液/1×10 8个细胞。转移细胞入15ml离心管。
  按照EasySep小鼠CD4 ⁺ CD62L ⁺初始T细胞分离方案。
  按照
  + CD62L ⁺ T细胞分离的步骤media/files/pis/28098-PIS_1_0_1.pdf？_ga = 1.200482282.511929587.1455301590"target ="_ blank"> EasySep ^TM kit
  注意：
  1. 初始小鼠脾脏中的细胞总数是（〜1×10 8个），没有RBC裂解。我们通常在纯化步骤后获得5-7百万个初始CD4 T细胞。
  2. 确保富集后分离的CD4 + T细胞的纯度高于95％（参见图1）。取小份等分的纯化细胞（5,000-10,000个细胞），并在冰冷的FACS缓冲液中在4℃下用抗CD4-Alexa Flour 700（1:100）和抗CD62L-FITC（1:100）染色30分钟。在用FACS缓冲液检查纯度后，使用流式细胞仪通过门控CD4 + CD62L + T细胞洗涤。

Th17细胞分化

准备2x Th17分化条件培养基（参见配方）
每孔加入100μl2x Th17分化条件培养基。
在37℃和5％CO 2下在组织培养箱中再培养3天。在分化后第2天将看到几个T细胞簇，培养基将变为轻微黄色。如果介质变得非常淡黄色，那么添加额外50ul完整的IMDM介质（见配方）。

图1.初始CD4T细胞纯化和Th17分化 A.流式细胞术点图显示脾淋巴细胞（左），CD4 +细胞（中）和频率的百分比的纯化的初始CD4 + CD62L + sup/+ T细胞。 B.数据显示分化后第3天产生IL-17的Th17细胞

活化和染色

在分化后第3天后，使用多通道移液管将细胞转移到U底96孔板中（轻轻地上下吹打以重悬细胞），并在300×g离心5分钟室内温度。
通过快速单一动作甩板消除上清液。要甩掉上清液，将平板向上移动并将平直向下。用棉纸轻轻地触摸板以去除液滴。涡旋板使用台式涡旋Genie2或任何微型涡流混合器。按照这些步骤进行洗涤和倾析上清液。
向细胞中加入200μl含有50ng/ml PMA，750ng/ml离子霉素和GolgiStop（1:1000）的完全IMDM培养基，并在37℃和5％CO 2中孵育4小时，在组织培养孵化器中
用200μl冰冷的FACS缓冲液（300×g，5分钟，4℃）洗涤两次。通过快速单次移动甩板消除上清液。
将细胞重悬在含有抗小鼠CD3-eFluor 450（1:100），抗小鼠CD4-Alexa Fluor 700（1:100）的100μl冰冷FACS缓冲液中并在4℃（冰箱）孵育30分钟，。
用FACS缓冲液（300G，2分钟，4℃）洗涤细胞
修复细胞与100微升BD Cytofix/Cytoperm在4℃下20分钟。通过快速单次移动甩板消除上清液。
用200μl1x BD Perm/Wash TM缓冲液（300×g，2分钟，4℃）洗涤两次。通过快速单次移动甩板消除上清液。
加入100μl含有抗IL-17A-PE（1:100）和抗IL-22-APC（1:100）抗体的1x BD Perm/Wash 缓冲液，并孵育45分钟/在4℃过夜。
代替表面染色步骤，包括表面（抗小鼠CD3-eFluor 450，抗小鼠CD4-Alexa Fluor 700）和细胞内（抗小鼠IL-17A-PE和抗小鼠IL-22-APC）的所有抗体在固定和Perm/Wash后在一个单一的步骤中一起使用。我们已经用细胞内细胞因子以及针对CD3和CD4的表面抗体染色细胞
用200μl1x BD Perm/Wash TM缓冲液（300×g，5分钟，4℃）洗涤细胞两次。重悬在200μlFACS缓冲液中的沉淀。
通过FACS确定细胞内IL-17A和IL-22的水平来确认Th17细胞的谱系。良好的Th17分化将导致20-40％产生IL-17A的CD4T细胞。

数据分析

可以使用FACS Diva或Flow Jo软件分析数据。绘制线性FSC对SSC点图，并创建一个门（P1）以选择所有单元格。使用P1群体绘制线性CD3对CD4点图。大多数分化细胞对CD3和CD4都是阳性的。将分析CD3阳性群体（门P2）的细胞内IL-17和IL-22染色。

食谱

完全IMDM培养基（使用前在37°C预热）
IMDM培养基+谷氨酰胺
10％FBS
1％青霉素/链霉素溶液
2x Th17分化条件培养基
完全IMDM培养基（37℃预热），含有：
10 ng/ml TGF-β1
80ng/ml重组IL-6 20ng/ml重组IL-23 10μg/ml抗IFNγ 10μg/ml抗IL-4抗体
FACS缓冲区
PBS用
0.5％牛血清白蛋白（BSA）
0.05％叠氮化钠

致谢

作者要感谢以下PHS拨款的支持：P50HL084932，5R01HL061271和R37HL079142到J.K.K. P.K得到匹兹堡儿童医院研究咨询委员会从匹兹堡儿童医院获得的UPMC健康体系的支持。

参考文献

Kumar，P.，Monin，L.，Castillo，P.，Elsegeiny，W.，Horne，W.，Eddens，T.，Vikram，A.，Good，M.，Schoenborn，AA，Bibby，K.，Montelaro ，RC，Metzger，DW，Gulati，AS和Kolls，JK（2016）。肠道白介素-17受体信号介导肠道微生物群和自身免疫炎症的相互控制。 44（3）：659-671。