材料和试剂

活细胞显微镜兼容的培养皿或腔室（例如，Ibidi，目录号：35mmμ-栅格）
粘附细胞系，例如，U2OS
如果在您的显微镜下没有CO 对照，则使用不含酚红的CO 2独立培养基（例如，Leibovitz的L-15培养基或补充有10％FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>）的DMEM培养基（CO 2 CO 2独立培养基，Thermo Fisher Scientific，Gibco <-目录号：18045088），目录号：10082139）和抗生素（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140-122）。或者，可以将HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）加入到您选择的培养基中
5-溴-2'-脱氧胞苷（例如，Santa Cruz Biotechology，目录号：1022-79-3）
Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：H1399）
PBS中的4％甲醛（Santa Cruz Biotechology，目录号：30525-89-4）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：234729）注意：此产品已停产。
小鼠抗γH2AX（EMD Milipore，目录号：05-636）
驴抗小鼠IgG（H + L）第二抗体Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A-21202）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503-500g）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379-500ML）
任选的：编码感兴趣的荧光标记的蛋白质的质粒，例如GFP-永久的（图1）。已知涉及不同DNA修复途径的荧光标记的蛋白质，如PARP-1，XRCC1或53BP1，可用作控制以建立最佳条件。
可选：选择的转染试剂，例如。，自制PEI解决方案或商业分销商

设备

装备有405nm激光器和环境室或插入物以控制温度和CO 2 2 /湿度用于长期活细胞实验的倒置共聚焦或旋转圆盘显微镜，例如。，装备有UV透射Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC M27或Plan-Apochromat 40x/1.30 Oil DIC M27物镜的Zeiss LSM710或LSM780共聚焦激光扫描显微镜，分别为
细胞培养箱

软件

显微镜软件，例如来自Zeiss（Zeiss）的ZEN，
Microsoft Excel（Microsoft）
图片J（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

在开始微辐射实验之前2-3天，在35mm的μ网格盘（Ibidi）中种子4-9×10 4 U2OS细胞/ml。在微辐照和免疫荧光染色后，使用带网格的盘来重新定位细胞
可选：在微辐照实验前24-48小时用编码感兴趣的荧光标记的蛋白质的质粒转染细胞。在我们的手jetPEI在U2OS细胞中提供良好的转染效率
激光微注射对细胞DNA损伤诱导的敏感性

BrdU致敏：在微辐射实验前将细胞在含有10μMBrdU的培养基中孵育至少24小时。 BrdU是胸苷的类似物，其在DNA复制期间掺入DNA，并且在用405nm激光照射时，将通过例如自由基形成诱导DNA损伤。
Hoechst致敏：在微辐照实验前将细胞在含有10μg/ml Hoechst的培养基中孵育10分钟。 Hoechst是一种细胞渗透性DNA染料，其结合到DNA的小沟。当Hoechst被紫外光激发时，使用405nm激光的局部微辐射将产生DNA损伤。使用Hoechst或BrdU进行敏化

将补充有10％FBS和不含酚红的抗生素的预热的CO 2 2活性细胞培养基加入细胞中以使自发荧光最小化。
DNA损伤诱导随后活细胞成像（图1）

点照射：对于表达感兴趣的荧光标记的蛋白质的活细胞中的DNA损伤诱导，用405nm二极管激光器照射细胞核内的衍射受限斑点（Xie等人，2015）（405nm激光设置为70％，1次迭代，缩放5，像素停留时间177.32μs）
线照射：对于表达感兴趣的荧光标记的蛋白质的活细胞中的DNA损伤诱导，用405nm二极管激光器照射5像素宽的条带（Xie等人，2015）（405nm激光设备到24％，1次迭代，缩放5，像素停留时间12.61μs）。
活细胞成像：在2秒时间间隔（通常6个预照射和60个后照射帧，帧大小512×512像素，像素大小90nm）的一个中间z剖面的微射线记录共焦图像系列之前和之后，，使用激光线根据所选择的报道蛋白的激发光谱（例如，对于GFP /标记的永恒的，488nm Ar激光），

DNA损伤诱导，随后免疫荧光染色
1. 激光微辐射：使用ZEN软件的FRAP模块（线扫描，405nm激光设置为92％，50次迭代）或瓦片扫描模式（Xie等人，2015; Baldeyron& 2011）（3×3块，图像大小128×128，扫描速度177.32μs，每扫描7次扫描，405nm激光设置为30％）。
2. 固定和免疫荧光：
注意：405nm激光的强度可以在不同的显微镜之间变化。因此，必须首先确定最佳激光设置，例如改变激光强度，然后用诸如γH2AX，PAR或胸腺嘧啶二聚体的DNA损伤标记物染色。应该使用引起例如γH2AX的清晰条纹的设置，而泛核染色表明所使用的激光强度太高。致敏方法也可以根据应该分析什么样的DNA修复途径而改变，例如单链断裂修复与双链断裂修复。

数据分析

为了评估募集动力学，对照射区域的荧光强度针对背景和荧光在整个时间过程中的总核损失进行校正，并归一化为预照射值。对于微辐照实验的定量评价，来自三次独立实验的至少10-20个核的数据应当被平均，并且使用Microsoft Excel软件计算和显示平均值曲线和平均值的标准误差。

图像配准和荧光强度测量
为了在图像采集期间补偿x和y方向上的潜在单元移动，可以使用来自ImageJ的TurboReg插件。

在ImageJ中打开文件

显示投资回报率
拆分渠道

复制图像系列的第一个图像，这将用作图像注册的模板
Turbo reg

源 - 原始图像系列
目标 - 新图片
选择刚性身体，并设置质量快速
批次=运动补偿
将新文件另存为tiff

对于分析，定义ImageJ中的三个不同的感兴趣区域（ROI）

ROI _{i =照射区域（点或线ROI）}
ROI _n =细胞核的轮廓
ROI _b =单元格外的背景区域

向ROI经理添加ROI（编辑→选择→添加到经理），选择多个测量并保存投资回报和测量（可以在编辑→选项→输入/输出中选择测量类型）
将度量复制到Microsoft Excel

从核（ROI n）和照射区域（ROI i）的荧光强度中减去背景强度（ROI b）：ROI ib = ROI _i - ROI _b和ROI _nb = ROI _n
为了补偿在采集期间的漂白并将预照射值设置为1，使用双归一化：（ROI /ROI> nb /sub>/ROI _{ib t}）
其中，ROI和ROI是在时间点t的荧光强度值，并且ROI _{ib t0}和ROI _{nb t0}分别是在时间点零时的荧光强度（预照射值）

图1.确定在固定和活细胞中激光诱导的DNA损伤位点的蛋白质募集。A.使用平铺扫描模式在大量细胞中诱导DNA损伤的微辐照程序的示意图随后通过固定和免疫荧光分析或表达感兴趣的荧光标记蛋白的单细胞的线和点照射，随后进行活细胞成像。 B.使用Zeiss LSM780的瓷砖扫描模式的微光辐照后的代表性共聚焦图像。将U2OS细胞进行显微照射，在指定的时间点后固定，并用针对γH2AX和RPA的抗体染色，其可用作双链断裂和ssDNA形成的标记以鉴定DNA损伤位点。 C.用编码GFP /标记的永恒的表达质粒转染的U2OS细胞进行微照射，并且GFP-Timeless的募集在实时/时间中以2秒的时间间隔进行。

笔记

为了确保实验之间的再现性，可以使用激光功率计来测量405nm激光强度。或者，可以使用针对例如γH2AX的参照抗体作为阳性对照的常规免疫荧光染色。

食谱

固定溶液
4％甲醛的PBS溶液
渗透溶液
0.5％Triton X-100的PBS溶液中
封锁解决方案
4％BSA的PBS溶液
洗涤缓冲液
0.05％Tween 20的PBS溶液

致谢

这项工作由Helleday基金会支持。该协议已经改编自以下出版物：Walter等人。（2003），Mortusewicz等人。（2008），Xie等人。（2015），Mortusewicz等人。（2016），Mortusewicz等人。（2007）和Mortusewicz等人。（2006）。

参考文献

Baldeyron，C.，Soria，G.，Roche，D.，Cook，AJ和Almouzni，G。（2011）。
Mortusewicz，O.，Amé，JC，Schreiber，V.and Leonhardt，H。（2007）。 PARP-1的反馈调节的聚（ADP-核糖基）是快速应答活细胞中DNA损伤所必需的。 em> 35（22）：7665-7675。
Mortusewicz，O.，Evers，B. and Helleday，T。（2016）。 PC4通过在DNA损伤位点结合ssDNA来促进基因组稳定性和DNA修复。癌基因 35（6）：761-770。
Mortusewicz，O.，Leonhardt，H. and Cardoso，MC（2008）。在DNA损伤位点调节蛋白质募集的时空动力学。

J Cell Biochem 104（5）：1562-1569。
Mortusewicz，O.，Rothbauer，U.，Cardoso，MC和Leonhardt，H。（2006）。 DNA连接酶I和III到DNA修复位点的差异募集。核酸研究 34（12）：3523-3532。
Walter，J.，Cremer，T.，Miyagawa，K.and Tashiro，S。（2003）。用于活细胞激光UVA微照射的新系统。 J Microsc 209（Pt 2）：71-75。
Xue，S.，Mortusewicz，O.，Ma，HT，Herr，P.，Poon，RY，Helleday，T。和Qian，C。（2015）。 Timeless与PARP-1相互作用以促进同源重组修复。 Mol细胞 60 （1）：163-176。