材料和试剂

0.22μm瓶顶过滤器（Corning，目录号：431096）
玻璃管（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：14-961-32）
1,000ml离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：3120-1000）
30ml离心瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：3119-0050）
血清移液管，1例5 ml，10 ml，25 ml
微量离心管（Eppendorf，目录号：022364111）
铝箔（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：01-213-100）
25号针（BD，目录号：305122）
50ml聚丙烯管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
培养皿（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
小电剃刀刮动物
超级微滑块（VWR，目录号：48311-703）
保费盖玻璃（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-548-5P）
磁力搅拌棒
接种环（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：22-363-595）
1ml注射器（BD，目录号：309628）
酸洗的106μm玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G4649）
用于组织学的塑料包埋模具（Polysciences，目录号：18646D-1）
肺炎链球菌菌株-CW更容易从未包封的菌株如R6（ATCC，目录号：BAA-255）中纯化。
C57B16小鼠，雄性和雌性的混合物（THE JACKSON LABORATORY，目录号：000664）
水（Sigma-Aldrich，目录号：W3500-1L）
超纯水（例如：Milli-Q，EMD Millipore）
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）（EMD Millipore，目录号：105458）
无菌脱纤维绵羊血（i-Tek Medical Technologies，目录号：103-100-3）
甘油
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4390）
注意：此产品已停产。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：71382）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：208094）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25-10MG）
RNA酶A（Sigma-Aldrich，目录号：R6513-10MG）
氯化钙脱水物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C-3881）
胰蛋白酶（AMRESCO，目录号：M150）
α-淀粉酶（Sigma-Aldrich，目录号：A3176）
氯化锂（LiCl）（Sigma-Aldrich，目录号：L9650）
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
丙酮（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A946-4）
Pierce LAL生色内毒素定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：88282）
荧光素异硫氰酸酯异构体I（FITC）（Sigma-Aldrich，目录号：F7250）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Mediatech，目录号：21-030-CV）
多聚甲醛，16％w/v（Alfa Aesar，目录号：43368）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378）
Tissue Tek OCT复合物（SAKURA FINETEK USA，目录号：4583）
使用DAPI的Prolong Gold Antifade（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：P36931）
HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
Tris-base（Sigma-Aldrich，目录号：1070897600）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：320331-500ml）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：451614）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S-6014 ）
氯化镁六水合物（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M0250）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
MnSO 4·一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M7634）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
腺苷（Oakwood Products，目录号：093333）
尿苷（EMD Millipore，目录号：6680）
谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G8540）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126）
（B6）盐酸吡哆醇（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
泛酸钙（D-泛酸）（Sigma-Aldrich，目录号：P3161）
注意：此产品已停产。
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：5871-100GM）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R4500）
生物素（Sigma-Aldrich，目录号：B4639）
10N NaOH溶液（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：SS255-1）
硫酸亚铁七水合物（FeSO 4·7H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：I146-500）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C8027）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z4750）
氯化锰四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：M87-500）
丙酮酸（Sigma-Aldrich，目录号：107360-25g）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
酵母提取物（BD，Bacto ^TM，目录号：212750）
无水乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8625）
酪氨酸氨基酸技术（BD，Bacto ^TM，目录号：223120）
L-色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8941）
L-半胱氨酸HCL（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP376-100）
天冬酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A4284）
氯化胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：C7527）
干冰
在净化过程中用于治疗CW的溶液
1. 50 mM Tris-HCl，pH 7.0（参见配方）
2. 5％（v/v）SDS（见配方）
3. 1 M NaCl（见配方）
4. 100mM Tris，pH 7.5（参见Recipes）
5. 1M MgSO 4（参见配方）
6. 1 M CaCl 2（参见配方）
7. 1％（v/v）SDS（见配方）
8. 8 M LiCl（见配方）
9. 100mM EDTA（参见配方）
10. 碳酸盐缓冲液，pH 9.2（参见配方）
准备C + Y组件
1. '3合1'盐（参见食谱）
2. 20％葡萄糖（请参阅食谱）
3. 50％蔗糖（请参阅食谱）
4. 腺苷（2 mg/ml）（请参阅食谱） br />
5. 尿苷（2 mg/ml）（见食谱） br />
6. 谷氨酰胺（1 mg/ml）（请参阅食谱） br />
7. Adams I（请参阅食谱）
8. Adams II（请参阅配方）
9. 2％丙酮酸（请参阅食谱）
10. 1 M KH ₂ sub> （请参阅配方）
11. 1 MK _{HPO ₄ （见配方）}
12. 5％酵母提取物（请参阅食谱）
媒体准备
1. PreC媒体（请参阅配方）
2. 补充（见配方）
3. Adams III（请参阅食谱）
4. 1 M磷酸钾缓冲液（见配方） >
5. C + Y medium（请参阅食谱）

设备

37℃CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：3110）中。
台式微量离心机（Eppendorf，型号：5417C）
1,000 ml锥形瓶
4,000ml锥形瓶
Sorvall离心机RC 5C Plus和适用于离心管或瓶子的转子
500 ml烧杯
搅拌加热板
涡流搅拌器
Speed-vac（Savant，型号：SC110A）
水浴超声仪（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，型号：FS20）
加热垫
低温切片机（Microme，型号：HM505E）
Zeiss LSM 510 NLO Meta共聚焦显微镜
分光光度计（Turner，型号：340）
Spectra MAX340酶标仪在405 nm处测量吸光度（Molecular Device，型号：Spectra MAX340 ）

软件

Zen 2008软件包（Carl Zeiss MicroImaging，Inc。）
ImageJ（ imagej.net/Particle_Analysis ）
Graphpad Prism（图形板）

程序

肺炎球菌CW：肽聚糖 - 磷壁酸复合物的制备
注意：
1. 制备所有溶液，并用蒸馏水洗涤（使用来自Sigma [＃W3500]的细胞培养蒸馏水，具有低内毒素浓度）。
2. 在使用前过滤所有溶液（过滤器0.22μm）。
3. 最好使用新的干净的玻璃器皿和设备，以避免任何内毒素（LPS）污染。
4. 在大规模生长之前，检查血小板上的肺炎球菌菌种，无抗生素以确认没有污染。
5. 这里描述的方案使用C + Y培养基（参见Recipes）作为部分确定的生长培养基。其它市售可得的培养基也是合适的，但是具有更多样的污染组分，例如需要除去以获得纯制剂的内毒素。

制备肺炎链球菌的原液
CW可以从任何肺炎球菌菌株纯化。然而，对于未封装的菌株如R6（Tuomanen等人，1985b），该方法是最成功的。
1. 在含有3％（v/v）无菌去纤维蛋白的绵羊血液的TSA琼脂（每500ml水20g TSA，高压灭菌器）上的条纹菌株，并将板在37℃，5％CO 2下孵育16小时-18小时（图1）。在血琼脂上的生长允许溶血的可视化，这是S的特征。肺炎。
  
  图1.未封装的菌株R6在TSA血琼脂上的过夜生长。肺炎球菌的纯培养物是步骤A1b中制备的种子的细菌的来源。
2. 用接种环将所有菌落从琼脂平板上刮下，并接种到试管中的10ml C + Y培养基中。在37℃，5％CO 2孵育培养物。当培养物在620nm（OD 620）的光密度达到0.4时，通过在微量离心机中在1500×g，4℃下离心10分钟收获培养物。
3. 小心地取出培养物上清液。将细菌沉淀重悬于5ml冷冻培养基（2.5 ml C + Y培养基和2.5 ml 80％[v/v]甘油）中，制成1 ml等分试样。将股票储存在-80°C的冷冻管中。这些原液含有约1×10 7 cfu/ml。
大规模培养肺炎球菌
1. 准备10升C + Y培养基（见Recipes），并在三个4,000毫升锥形瓶（每瓶3,300毫升）中等分。在37℃，5％CO 2培养基中培养过夜，以确认无污染。
2. 将1ml /烧瓶的肺炎球菌原种（10 7 cfu/ml）接种到培养基中。在37℃，5％CO 2下孵育培养物，不摇动注意：
  1. 为了估计烧瓶中的细菌生长，当培养物开始出现混浊时，将一个10ml等分试样（使用无菌血清移液管）从烧瓶转移到无菌玻璃管中。读取此转移培养物在620nm的培养物浊度（OD 620）。保持细菌培养在玻璃管，并孵育在培养箱与烧瓶培养。随时间监测玻璃管培养物的OD <620>。
  2. 在烧瓶中的OD <620>将比在玻璃管中的OD620高大约0.1。
3. 当烧瓶中的OD 620达到0.7-0.8时，从培养箱中取出烧瓶并将其浸入冰中15分钟。每2分钟旋转烧瓶以快速冷却培养物
4. 将冷却的培养物倒入预冷的1,000ml离心瓶中，并通过在Sorvall离心机中在4℃，4,000xg离心10分钟收获培养物。
5. 通过倾倒小心倾析上清液。颗粒可以储存在-80°C直到使用
细菌细胞的初步收获和机械破碎
注意：粗制CW的操作定义是可以通过在SDS中煮沸而精制的物质。
1. 用10 ml /瓶冰冷的50 mM Tris-HCl，pH 7.0重悬每个沉淀（见Recipes）。注意：尽快执行此步骤以避免细菌自溶。
2. 在500ml烧杯中在热板上煮沸200ml 5％（v/v）SDS（参见Recipes）。仔细监测温度控制，以防止沸腾在烧杯的边缘。
3. 合并重悬的细菌沉淀并将细菌悬浮液缓慢加入沸腾的SDS中。
4. 将悬浮液煮沸15分钟，并冷却至室温。
5. 将煮沸的悬浮液等分到30ml离心管中。在Sorvall离心机中在室温下将悬浮液12,000×g离心10分钟。小心弃去上清液，避免移出沉淀。
6. 将沉淀重悬在20ml /管1M NaCl中（见Recipes）。在Sorvall离心机中在室温下将悬浮液12,000×g离心10分钟。轻轻小心地弃去上清液。重复此步骤另外2次。
7. 将沉淀重悬在20ml /管水中。在Sorvall离心机中在室温下将悬浮液12,000×g离心10分钟。轻轻小心地弃去上清液。重复此步骤另外7次，以去除洗涤剂。
8. 将沉淀重悬于2 ml水中，加入等体积的玻璃珠。
9. 涡旋球粒玻璃珠悬浮液在4°C，最大速度16-18小时。
消除DNA，RNA和蛋白质

通过在Sorvall离心机中在室温下离心5,000×10 5分钟收获断裂的CWs 10分钟。
小心地将上清液（包含CW）转移到新鲜的30ml离心管中
向沉淀中加入10ml水并剧烈涡旋。在室温下孵育悬浮液20分钟，通过沉降分离上清液。然后，用无菌血清移液管小心去除上清液。在步骤A4b中将上清液转移到离心管中。重复此步骤至少5次，直到上清液澄清
在Sorvall离心机中在室温下离心含有CW的上清液27,000×g 15分钟。
将上清液轻轻弃去，小心地将沉淀重悬于10ml 100mM Tris，pH7.5中（参见Recipes）。
将0.2ml 1M MgSO 4（参见Recipes）加入悬浮液中，使最终浓度为20mM。
加入10μlDNase I和50μlRNase A到悬浮液中，最终浓度分别为10和50μg/ml。在37℃下孵育悬浮液2小时
将0.1ml的1M CaCl 2（参见Recipes）加入悬浮液中，使最终浓度为10mM。
加入0.1ml胰蛋白酶（10mg/ml）使终浓度为100μg/ml和0.3U的α-淀粉酶。
孵育悬浮液在37℃下12-15小时。

去除非共价加合物和污染内毒素

将沉淀重悬在10ml 8M LiCl中（见Recipes），37℃孵育15分钟。
在Sorvall离心机中在室温下离心悬浮液27,000×g 15分钟。弃去上清液。
用10ml 100mM EDTA重悬沉淀（见Recipes），并在37℃下孵育15分钟。
将悬浮液在室温下，27,000×g离心15分钟。弃去上清液。
将沉淀重悬在10ml水中，在Sorvall离心机中在室温下离心悬浮液27,000×g 15分钟。弃去上清液。
将沉淀重悬在10ml丙酮中，在Sorvall离心机中在室温下离心悬浮液27,000×g 15分钟。丢弃上清液非常仔细，因为颗粒是非常松散的
将沉淀重悬在10ml水中，在Sorvall离心机中在室温下离心悬浮液27,000×g 15分钟。弃去上清液。重复此步骤5次。
将沉淀重悬于2ml水中。
根据制造商的说明，通过Pierce ^TM LAL生色内毒素定量试剂盒测试CW悬浮液的内毒素。
记录微量离心管的重量，并将CW悬浮液分装到试管中
在Speed-vac中冻干CW悬浮液。
记录含有冻干CW的管的重量。减去空管的重量以获得CW的质量。通过每46mg CW材料加入348μlH 2 O来重建干燥的CW，这导致CW原料相当于10 6 cfu /μl。将CW原液储存在4°C。
已经描述了这种CW材料的组成（Holtje等人，1975）。
注意：CW股票将有一个"乳白色"外观（图2）。

图2.纯化的肺炎球菌CW的最终外观

FITC标签

将所需的量（100-200μl，取决于小鼠的数量）从CW原液转移到新鲜的微量离心管中。
在水浴超声仪中超声处理CW 30分钟。
将超声处理的CW在500μlFITC溶液（1mg/ml，溶解于无菌碳酸盐缓冲液中;参见Recipes）中重悬。通过包装在铝箔中保护制剂免受光照。将悬浮液在室温下孵育1小时
在室温下将FITC标记的CW离心，在微量离心机中17,000×g离心2分钟。弃去上清液，并重悬于1ml DPBS中。重复此步骤2次。
将在DPBS中的FITC标记的CW沉淀物重悬浮至浓度为1×10 6个细菌当量/μl。

图3. FITC标记的肺炎球菌CW 的最终外观

胎盘和胎儿组织中CW分布的检测
所有实验应按照国家和机构指南（例如，国家卫生研究所）进行。
1. 一般说明
  为了研究CW分布到小鼠的胎盘和胎儿，将FITC标记的CW静脉内注射到妊娠小鼠中。购买雄性和雌性小鼠，并在动物设施中就地繁殖。通过异氟烷麻醉体重15-20g并且没有脱水或疾病迹象的健康小鼠。在整个操作过程中将小鼠保持在异氟烷下（约5-10分钟）。小鼠在〜15-20分钟内从10分钟程序恢复。
2. CW注射的小鼠
3. 在胚胎日E18-20收获组织
4. CW在胎盘和胎儿组织中的可视化
  
  图4.小鼠脑切片。切片，沿虚线切口。冠状切面是优选的，以去除小脑和创建平面嵌入皮层

数据分析

图5.通过显微镜记录和定量胎儿脑或胎盘中的FITC CW。使用ImageJ分析胎盘和胎儿脑组织中的CW分布的共焦图像（箭头）。

对每种处理条件进行三次独立实验，并将结果组合。使用Graphpad Prism（Graphpad）或具有双尾t检验的任何其它统计软件，用用于统计分析的Welch校正来分析数据。例如，在24小时内注射到母体循环中，CW跨越进入胚胎脑（图5）。约400个CW片/mm 2的CW密度对应于每个皮质板的4×10 5个CW片，表明约2％的接种物进入母亲被贩运到胎儿脑。

食谱

在净化过程中用于治疗CW的溶液
1. 50mM Tris-HCl，pH7.0（7.88g/L Trizma HCl）
2. 5％（v/v）SDS（50g/L）
3. 1M NaCl（58.44g/L）
4. 100mM Tris，pH7.5（12.11g/L Tris碱）
5. 1 M MgSO 4（246.47g/L）
6. 1 M CaCl 2（147g/L）
7. 1％（v/v）SDS（10g/L）
8. 8 M LiCl（339.12g/L）
9. 100mM EDTA（37.22g/L）
10. 50mM碳酸盐缓冲液，pH9.2 （5.5ml 0.1M Na ₂ CO sub style ="color：＃666666; font-family：Arial，Helvetica，sans-serif; text-align：justify; white-space：normal;"> 3 ，34ml 0.1M NaHCO ＃666666; font-family：Arial，Helvetica，sans-serif; text-align：justify; white-space：normal;"> 3 ，60.5ml Milli-Q H ₂ O）
制备C + Y肺炎球菌生长培养基成分
1. '3合1'盐
  50g MgCl 2·6H 2 O·dm / 0·25g CaCl 2水溶液
  0·1ml 1M MnSO 4溶液
  用Milli-Q水
  溶解于最终体积为500ml中
2. 20％葡萄糖 100g/500ml Milli-Q H 2 O（在500ml Milli-Q H 2 O中溶解100g葡萄糖）。
3. 50％蔗糖 50g/100ml Milli-Q H sub 2 O 2 /
4. 腺苷（2mg/ml）
  1克/500毫升Milli-Q H sub 2 O 2 /
5. 尿苷（2mg/ml）
  1克/500毫升Milli-Q H sub 2 O 2 /
6. 6·谷氨酰胺（1 mg/ml）
  0·5g/500ml Milli-Q H 2 O·v/v
7. 亚当斯我
  30mg烟酸（烟酸）
  35mg（B6）吡哆醇HCl 120毫克泛酸钙（D-泛酸）
  32mg硫胺素HCl 14mg核黄素
  溶解在200ml终体积Milli-Q H 2 O中加入0. 06 ml生物素（0.5 mg/ml原液，加入1滴1N NaOH进入溶液）
  店铺覆盖有箔
8. Adams II
  50mg FeSO 4·7H 2 O·h/v 50mg CuSO 4·5H 2 O·TiO 2 50mg ZnSO 4·7H 2 O·dm / 20mg MnCl 2·4H 2 O·dm/2 1 ml HCl
  添加Milli-Q H sub 2 O至最终体积为100 ml
9. 准备2％丙酮酸
  2 g丙酮酸
  100ml Milli-Q H sub 2 O 3 /
10. 1 M KH ₂ PO ₄
  13·6g/100ml Milli-Q H 2 O·
  121℃高压灭菌15分钟
11. 1 M K _{2 HPO ₄
  174·2g/1L Milli-Q H 2 O·
  121℃高压灭菌15分钟}
12. 5％酵母提取物
  5g/100ml Milli-Q H sub 2 O 2 / 121℃高压灭菌15分钟
  注意：
媒体准备
1. 准备PreC介质
  将以下物质溶于800ml Milli-Q水中
  4.83g乙酸钠 20克酪蛋白氨基酸
  20 mg L-色氨酸
  200 mg L-半胱氨酸HCL
  通过加入10N NaOH（用巴斯德吸管约14滴）将pH调节至7.4-7.6 在室温下搅拌（30-60分钟）用Milli-Q水将最终体积增加到4 L 等分400毫升到10×500毫升锥形瓶中
  在125℃下高压灭菌30分钟
2. 准备补充
  60ml 3'1'盐
  120ml 20％葡萄糖 6ml 50％蔗糖 120ml腺苷（2mg/ml）
  120ml尿苷（2mg/ml）在烧杯中混合并储存在200ml份
3. 准备亚当斯III
  800 mg天冬酰胺
  80 mg氯化胆碱
  0.64ml CaCl 2（1％溶液） 64 ml Adams I
  16 ml Adams II
  360ml Milli-Q H sub 2 O 2 / 混合并储存在带箔的烧瓶中
4. 制备1M磷酸钾缓冲液，pH 8.0
  26.5ml KH 2 PO 4（1M）
  473ml KH 2 PO 4（1M）
5. 混合以下量的前述组分用于C + Y
  400 ml PreC
  13 ml补充剂
  10ml谷氨酰胺（1mg/ml） 10ml Adams III
  5ml 2％丙酮酸 15ml 1M磷酸盐缓冲液 9ml 5％酵母提取物
  过滤灭菌并在4°C **
  保存温育至37°C，然后接种细菌
  注意：**预备的C + Y的保质期为1个月。

致谢

这项工作是由NIAID 27913和ALSAC支持的。

参考文献

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