材料和试剂

细胞培养容器，板和管
1. 50毫升Falcon管（TrueLine，目录号：TR2004 ）
2. 具有网格的细胞计数载玻片（KOVA，目录号：87144）
3. T75 75cm 2细胞培养瓶（TrueLine，目录号：TR6002 ）
4. 6孔细胞培养板（TrueLine，目录号：TR5000）
5. 24孔细胞培养板（TrueLine，目录号：TR5002）
6. 1.5ml Eppendorf管
7. 0.22μm细胞培养基过滤装置（LPS，目录号：1102-RLS）
假型病毒溶液过滤
1. 0.45μm滤镜（Pall，目录号：4184）
2. 10ml注射器（BD，目录号：309604）
移液器和移液器
1. Pipettor套装：
  P1000（Gilson，目录号：F123602）
  P200（Gilson，目录号：F123601）
  P20（Gilson，目录号：F123600）
2. 用于用血清移液管（Corning，目录号：CLS4910-1EA）移液的Stripettor
  注意：此产品已停产。
3. 无菌血清移液器：
  25ml（LPS，目录号：TR37129）
  10ml（LPS，目录号：TR37128）
  5ml（LPS，目录号：TR37127）
4. 中继器分配器（Eppendorf，目录号：4981000.019/022260201）
  注意：此产品已停产。
  10 ml无菌提示（Eppendorf，目录号：0030089677）
  5ml无菌尖端（Eppendorf，目录号：0030089561）
单元格
1. 将人胚胎肾（HEK）HEK-293T/17细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）保持在具有完全DMEM（DMEM-C）
2. 人肝Huh-7细胞（National Institutes of Biomedical Innovation，Health and Nutrition，目录号：JCRB0403），保持在具有DMEM-C的T75烧瓶中
转染质粒和试剂
1. 质粒pCMV-MLVgag-pol（氨苄青霉素抗性）（Bartosch等人，2003）
2. pTG-Luc（氨苄青霉素抗性）（Bartosch等人，2003）
3. pCAGGS-MERS-S（氨苄青霉素抗性）（Millet和Whittaker，2014）
4. pCAGGS-VSV-G（氨苄青霉素抗性）
5. pCAGGS（氨苄青霉素抗性）
6. Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11668-027）}
7. Opti-minimal必需培养基（Opti-MEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：31985-070）
消毒/去污试剂
1. 在喷雾瓶中用水稀释至70％的乙醇（95％）（VWR，BDH ，目录号：BDH1158-4LP）
2. 纸巾浸泡在70％乙醇中并擦拭表面以消毒（Georgia-Pacific Consumer Products，目录号：23304）
3. 用于去污的漂白溶液（Clorox公司，目录号：Germicidal Bleach ）
细胞培养试剂
1. 0.25％胰蛋白酶EDTA溶液，目录号：25-053-C1）
2. Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS），其中所述Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DBS）与Ca 2+和Mg 2+的混合物（Mediatech，目录号：21-030-CV）
3. 对于Eagles培养基（DMEM）的Dulbecco's修饰，热灭活的胎牛血清FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：1614071）
4. <100>青霉素 - 链霉素（PS）> 100x青霉素 - 链霉素（PS），100x青霉素 - 链霉素（PS），100x青霉素 - 链霉素（PS）溶液（Mediatech，目录号：30-002-C1）
5. 1 M N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）溶液（Mediatech，目录号：25-060-Cl）
荧光素酶测定试剂
1. 荧光素酶测定裂解缓冲液（Promega，目录号：E1531）
2. 荧光素底物（Promega，目录号：E1501）
3. 无菌水（VWR，目录号：E476-1L）
其他
1. 冷冻机
2. 完全DMEM（DMEM-C）（见配方）
3. 转染DMEM（DMEM-T）（见Recipes ）

设备

温控水浴（Labnet，型号：W1106A）
连接到真空吸气系统（Labonco，型号：3440009）的生物安全柜（II-A2级）
倒置光学显微镜用10x物镜（尼康仪器，型号：TS100）检查细胞密度和健康
在37℃，5％CO 2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific< sup>，型号：13-687-704）中的板摇床
板式摇臂，室温（VWR，型号：40000-300）
37℃5％CO 2加湿的细胞培养箱 - Symphony（VWR，型号：98000-368）
Vortex Genie（Scientific Industries，型号：G560）
口袋计算器（Sharp Elsimate，Sharp，型号：EL-334TB）
与CCD照相机（PCO，型号：Sensicam QE）连接的带有10倍物镜的倒置光学显微镜（Carl Zeiss，型号：Axiovert 200）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
GloMax 20/20发光计（Promega，型号：2030-100）
设置在4℃的实验室冰箱（GE Appliances，型号：GMR06AAMBRWW）
实验室冷冻机设置在-20℃（SUMMIT APPLIANCE，型号：FS-603）
设置在-80℃的实验室冷冻器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：UXF30086A）
计时器（VWR，目录号：61161-346）

软件

Prism（GraphPad，版本7 ）

程序

第1天

细胞培养程序制备（每当细胞和病毒假型颗粒被操作时进行） - 参见注释1关于细胞培养的基本建议。
1. 在37℃水浴中需要预温热的细胞培养试剂：DMEM-C，DPBS，胰蛋白酶。
  注意：这是特别重要的步骤，因为HEK-293T/17细胞粘附不良 - 详见注释2。
2. 在开始操作之前，打开生物安全柜至少15分钟。
3. 用70％乙醇浸泡的纸巾消毒生物安全柜（顶部烤架除外）的所有内表面。
细胞接种（在生物安全柜中进行）
1. 在灭菌的生物安全柜中放置含有HEK-293T/17细胞的80-90％汇合T75培养瓶（使用倒置光学显微镜目视检查）。
2. 用10ml预热的DPBS洗涤细胞两次，小心不要直接将液体分配到细胞上
3. 用1ml预热的胰蛋白酶溶液胰蛋白酶消化细胞
4. 用手轻轻摇动板，使胰蛋白酶溶液覆盖细胞单层的整个表面
5. 在37°C 5％CO 孵育细胞 ₂ -5分钟，避免更长的孵化时间。
  family：Arial;"> style ="font-family：Arial;"> span style ="font-family：Arial;"> > psin潜伏期，因为这通常导致细胞聚集 - 参见注释3.
6. 轻轻敲击烧瓶侧面以分离细胞。
7. 将胰蛋白酶消毒的烧瓶放回生物安全柜。
8. 加入4ml温热的DMEM-C以中和胰蛋白酶活性
9. 通过使用5ml血清移液管重复上下移液重悬细胞
10. 向细胞中加入5 ml DMEM-C，并重新悬浮细胞
11. 转移10ml细胞悬浮液到50ml Falcon管
12. 轻轻涡旋细胞30秒。
13. 使用P20移液器和适当的尖端转移10微升细胞悬液到细胞计数室
14. 在倒置光学显微镜下使用细胞计数室计数细胞
15. 使用计算器计算细胞密度。
16. 加入DMEM-C以获得5×10 5细胞/ml的最终细胞密度。
17. 通过上下移液重悬细胞，轻轻涡旋管
18. 通过每孔加入2ml细胞（1百万细胞）将细胞接种到6孔板的孔中
19. 轻轻地来回摇摆（避免旋转运动），侧向和对角
20. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育平板16-18小时

第2天

转染（在生物安全柜中进行）
1. 使用光学显微镜检查细胞融合 - 理想的细胞应在约40-60％融合，见图1.
  
  图1.转染前的HEK-293T/17细胞融合。为了有效转染和假型颗粒生产，HEK-293T/17细胞融合应该在大约40-60％范围，如用蔡司Axiovert 200显微镜拍摄的上述显微镜照片中所示。比例尺表示100μm
2. 温热Opti-MEM在37℃培养箱。
3. 计算混合物A所需的质粒DNA和Opti-MEM的量（对于6孔板的1个孔给出的量可以根据需要按比例放大或缩小）。
  对于6孔板的1个孔（1μg总DNA转染）：
  pCMV-MLVgag-pol 300 ng
  pTG-Luc 400 ng
  包络编码或空向量 300纳克
  至50微升
  注意：
  1. 如果需要，可以优化DNA比例 - 见注4。
  2. 此外，此协议使用6孔板格式执行。这可以根据实验要求放大或缩小 - 请参见注释5。
4. 包括转染条件，其中将pCMV-MLVgag-pol和pTG-Luc与用于阳性对照颗粒的质粒（VSV-Gpp）共转染。 /em>。与pCAGGS-VSV-G）和阴性对照颗粒（Δenvpp， e em> ，使用pCAGGS空载体） - 有关假型粒子控制的详细信息，请参见注释6。
5. 计算混合物B所需的Lipofectamine 2000转染试剂的体积对于6孔板的1个孔（使用1：3比例，1μgDNA对于3μlLipofectamine 2000）：
  Lipofectamine 2000 3微升
  Opti-MEM 47微升
  注意：如果需要，可以优化1：3的比率。
6. 在每个转染条件的混合物A和B的体积计算中包括2个'安全'孔，以避免在多个孔中进行相同转染时不使用溶液。
7. 处理Lipofectamine 2000试剂时要小心避免与塑料表面（管壁）直接接触，并且始终在已经含有液体溶液的管中进行分配。
8. 根据计算进行混合A和混合B稀释。
9. 在室温下孵育5分钟。
10. 使用1：1比例（ i 混合A和B，并通过进行多次上下移液混合溶液。
11. 在室温下孵育20分钟。
12. 将要转染的细胞平板置于培养箱中，待转染的标记孔用所用的病毒包膜名称。
13. 轻轻吸出上清液，替换为1毫升温热的Opti-MEM。
14. 每孔加入100微升的转染混合物以逐滴的方式。
15. 轻轻摇动板前，后和侧面。
16. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育4-6小时。
17. 在37℃水浴中预热转染DMEM（DMEM-T，无抗生素）。
  注意：此处使用DMEM-T代替DMEM-C，因为转染试剂增加细胞膜通透性，这导致增强对细胞培养基中抗生素的细胞毒性作用的易感性 - 参见注释4。
18. 轻轻地加入1毫升DMEM-T到每个孔。
19. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育48小时

第4天

收获（在生物安全柜中进行）
1. 标记具有假型病毒（使用的包膜糖蛋白）名称的cryovials，收获日期和用户姓名首字母。
2. 在50ml Falcon管中收集上清液（如果它们被相同转染，可以汇集来自多个孔的溶液）
3. 在290分钟的离心机中离心管，每次7分钟。
4. 使用合适的注射器通过0.45μm过滤器传递假型病毒溶液
5. 分装标记的冷冻瓶中的等分试样溶液（，1ml等分试样）。
6. 储存管在-80°C - 有关储存的详细信息，请参见注释7
7. 用10％漂白溶液净化所有培养容器，血清移液管，与假型病毒溶液接触的注射器，最短接触时间为15分钟。
  注意：此协议描述如何产生和使用假型颗粒感染性测定。为了估计产生的颗粒的数量以及将特定病毒包膜糖蛋白掺入颗粒中，需要另外的实验，例如蛋白质印迹分析或ELISA测定 - 详见注释8。
用于感染的细胞接种（在生物安全柜中进行）
1. 将含有Huh-7细胞的80-90％融合T75瓶放在生物安全柜中
2. 用10ml温热的DPBS洗涤细胞两次，小心不要直接将液体分配到细胞上
3. 用1ml温热的胰蛋白酶溶液胰蛋白酶消化细胞
4. 用手轻轻摇动板，使胰蛋白酶溶液覆盖细胞单层的整个表面
5. 孵育细胞在37℃，5％CO 2培养箱中3-5分钟，避免更长的孵育时间。
  注意：重要的是避免长时间的胰蛋白酶孵育时间，因为这通常导致细胞以及细胞的聚集。计数和密度问题 - 请参阅注释3.
6. 轻轻敲击烧瓶两侧以分离细胞
7. 将胰蛋白酶化的烧瓶放回生物安全柜。
8. 加入4ml温热的DMEM-C以中和胰蛋白酶活性
9. 通过使用5ml血清移液器重复上下移液重悬细胞
10. 向细胞中加入2-3ml DMEM-C，并再次悬浮细胞（根据细胞汇合程度进行调整）
11. 将细胞悬液转移到50ml Falcon管
12. 轻轻涡旋细胞约30秒。
13. 使用P20移液器和适当的尖端转移10微升细胞悬液到细胞计数室
14. 在光学显微镜下使用细胞计数室计数细胞
15. 使用袖珍计算器计算细胞密度。
16. 加入DMEM-C以获得5×10 5细胞/ml的最终细胞密度。
17. 通过上下移液重悬细胞，轻轻涡旋管
18. 通过使用中继器分配器每孔加入500μl细胞（2.5×10 5个细胞）将细胞接种到24孔板的孔中。
  注意：感染在24孔板中进行。这可以根据实验要求进行放大或缩小 - 详情请参阅注释5。
19. 轻轻地来回摇摆（避免旋转运动），侧向和对角的板
20. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育平板16-18小时

第5天

感染（在生物安全柜中进行）
1. 使用光学显微镜检查Huh-7细胞融合（细胞应该几乎融合，如图2所示）。
  
  图2.感染前的Huh-7细胞融合与假型颗粒。为了通过假型颗粒的有效转导，Huh-7细胞应该几乎完全融合，如用Zeiss Axiovert 200显微镜拍摄的上述显微镜照片所示。比例尺表示100μm。
2. 在37℃水浴中预热DPBS
3. 在室温下解冻假型病毒溶液小瓶（小瓶然后可以保存在冰上）
4. 将具有Huh-7单层的24孔板置于生物安全柜中
5. 用200μl温热的DPBS洗涤三次，小心不要直接将液体分配到细胞上
6. 用200μl假型病毒溶液接种孔
7. 通过每孔加入200μlDMEM-C溶液包括非感染（n.i.）对照条件
8. 将板放置在位于37℃，5％CO 2细胞培养箱中的摇床上。
  注意：或者，细胞可以放置在没有摇杆的孵化器中。
9. 孵育细胞1-2小时。
10. 在37℃水浴中预温热DMEM-C
11. 加入300微升DMEM-C使用中继器分配器和适当的提示
12. 在37℃，5％CO 2细胞培养箱中孵育72小时。
  注意：如果需要，可以优化此感染时间，请参阅注释9。
13. 用10％漂白溶液净化所有与假型病毒溶液接触的培养容器和移液管吸头，最短接触时间为15分钟。

第8天

荧光素酶测定（在生物安全柜中进行，直到步骤G5）
1. 在室温下使萤光素酶测定裂解缓冲液（储存在-20℃）和荧光素底物（储存于-80℃）。
2. 将含有感染细胞的平板置于生物安全柜中，孵育直至温度平衡至室温。
3. 用无菌水稀释至1×荧光素酶测定裂解缓冲液。
4. 轻轻吸出细胞的上清液。
5. 加入100微升1荧光素酶测定裂解缓冲液到每个井使用中继分配器。
6. 在摇床上室温孵育15分钟（孵化后，板可以在生物安全柜外部打开）。
7. 打开GloMax 20/20发光计。
8. 准备清除1.5毫升Eppendorf管的每个孔，以分析每个管中分配20微升荧光素底物溶液。
9. 加入10μl裂解的细胞上清液到每个20μl含荧光素的管，执行快速上下移液和龙胆闪烁立即，然后将管放置在光度计中发现的管架。
10. P style ="font-size：10pt; font-family：Arial;">发光计触摸屏上的'测量发光'按钮。
11. 记录相对荧光素酶单位（RLU）的读数。
12. 对其他孔重复测量记录（步骤G8-G11）程序。

数据分析

收集每种类型的假病毒颗粒的数据（冠状病毒穗 - 假型颗粒（CoVpp）的典型值是在10 4 -10 -10 6 RLU范围内，VSV-Gpp 10 ⁶ -10 ⁸ RLU范围和Δenvpp在10 ^{基线RLU范围内）。如果光度计连接到计算机，则可以使用提供的软件将数据记录在电子文件中。}
至少包括对所分析的每种感染状况的重复测量
用于统计显着性分析的独立实验的平均测量
使用图形绘图软件（如Prism 7）绘制数据（绘制数据的示例如图3所示）。

图3.人类肝细胞（Huh-7）中的MERS-CoV S-ps e udotyped颗粒感染性测定。显示感染后72小时裂解的Huh-7细胞对于以下条件的荧光素酶活性测量：未感染（ni），"秃发"（无包膜）假型包装颗粒（Δenvpp），VSV-G-假型化颗粒（VSV-Gpp）和MERS-CoV S假型化颗粒（MERS-Spp）。以一式三份进行的实验和呈现的数据是三个独立实验（n = 3）的平均相对荧光素酶单位（log 10 10）。误差线表示标准偏差（s.d.）。

笔记

细胞培养和转染
选择HEK-293T/17细胞用于转染和产生假型颗粒，因为它们能够被非常有效地转染。在这个协议中，选择Huh-7细胞作为由假型颗粒感染的靶细胞，因为它们对于天然MERS-CoV和MERS-CoV S假型化颗粒感染是非常允许的。当生产其他类型的假病毒时，我们建议检查什么是最合适的细胞系的感染性测定。由于细胞系是产生假型颗粒和感染测定的基础，因此通过尽可能使用新鲜制备的培养基经常传代它们以避免过度生长细胞单层，并且尽可能保持它们是必要的，当转染或感染它们时。细胞系的健康和生长不良常常导致转染和感染率低，因此在处理细胞时要小心。
HEK-293T/17细胞粘附
HEK-293T/17细胞对于该方案非常有用，因为它们通常允许非常高的转染率。然而，这些细胞倾向于粘附到细胞培养物处理的表面，并且即使没有胰蛋白酶也容易分离。由于这个原因，在进行洗涤时使用预热的含有DPBS的DPBS是重要的，因为这些阳离子有助于细胞粘附。此外，建议使用涂有聚-D-赖氨酸的细胞培养表面（稀释至40μg/ml的涂布溶液）来帮助细胞粘附。
胰蛋白酶处理细胞
当胰蛋白酶化细胞，特别是Huh-7细胞时，我们发现在37℃，5％CO 2培养箱中孵育超过5分钟对于计数和细胞接种是有害的，因为细胞会聚集并且不会长形式均匀分布的细胞单层。我们建议在胰蛋白酶处理细胞时小心，避免与蛋白酶长时间孵育
转染建议
如果需要，还可以优化使用的质粒DNA（300ng pCMV-MLVgag-pol：400ng pTG-Luc：300ng包膜编码或空载体）的量的比例（例如假病毒感染性），但我们建议保持pCMV-MLVgag-pol和pTG-Luc载体的量恒定，并改变包膜编码载体的量。此外，在本协议中，我们使用1微克DNA：3微升Lipofectamine 2000比率的转染，这已经非常好地为我们的假型颗粒生产。然而，根据所使用的表达质粒和细胞系，进行该比例的测试和优化可能是有用的。此外，由于转染程序增加细胞膜通透性，重要的是要避免在那段时间内细胞的抗生素治疗。这样做确保与转染相关的细胞毒性保持低。
假型颗粒生产和感染扩展
使用6孔板进行以下方案用于HEK-293T/17生产细胞的转染。从6孔板的一个孔中，可以收获约2ml假型化的颗粒上清液。如果需要更多的假型颗粒溶液，可以在多个孔中进行相同的转染，在收获阶段收集上清液。还可以根据需要，通过使用其他培养容器（例如10cm培养皿或烧瓶）并通过相应地调整转染条件，将方案放大或缩小。协议还详细说明如何使用24孔板进行靶细胞与假型化颗粒的感染。这也可以适应实验的需要，例如对于高通量实验，可以通过调整体积和使用板兼容的光度计来优化用于在96孔板中进行的感染的测定。
假型颗粒生产控制
在假型颗粒的生产过程中，重要的是包括颗粒生产控制，这是本协议详述的一个重要步骤。通常，通过用空载体对照代替编码异源病毒包膜糖蛋白的质粒来产生"秃头"或"Δenv"颗粒（Δenvpp）。这些颗粒从生产细胞中出芽，但是没有病毒包膜糖蛋白。此外，阳性对照也可用于测量进行该程序的良好程度，并且通常使用VSV-G假型化颗粒（VSV-Gpp）用于此。这些颗粒通常在许多细胞类型中达到非常高的感染性，因此是理想的阳性对照
假型粒子存储
当在-80℃下储存几个月时，基于MLV的假型包装颗粒保持良好的感染性。然而，我们建议避免多个冻融循环，因为这些可以显着降低病毒感染性。我们建议将假病毒库存分成小体积（1 ml）和解冻正在进行的每次感染实验所需的。
产生的颗粒的定量和包膜糖蛋白掺入该协议详细说明了假型颗粒生产和感染的程序。然而，它没有描述用于测量每个批次产生的颗粒量的方法，这是重要的步骤，特别是当比较用不同类型的病毒包膜糖蛋白假型包装的假病毒颗粒的感染性时。这样的定量可以使用几种方法进行，例如ELISA或Western印迹技术（如[Jaume] /em>。，2011; Millet e ），允许估计从生产细胞释放的总衣壳蛋白（用于MLV的p30蛋白）或使用直接总颗粒计数和使用诸如Nanosight（Millet）的装置进行分析。。 Western印迹技术还允许探测异源性包膜蛋白，这对于评估其在假型颗粒中的掺入效率非常有用。
孵化时间
孵育时间（生产过程中48小时和感染测定中72小时）已针对MERS-CoV S假型化颗粒进行了优化。这些孵育时间可用作产生其它类型假病毒的指导，然而，我们建议测试不同的孵育时间以优化病毒生产和感染性。
假型包装多于一种包膜糖蛋白
该方案描述了产生仅包含一种包膜糖蛋白的假型化颗粒的方法，例如在MERS-Spp的情况下的MERS-CoV S蛋白。然而，使用共转染策略，可以并入多于单个的包膜蛋白。例如，我们已经成功地产生流感血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）假型病毒（Millet和Whittaker，2014; Tse > l 。，2014）。
通过C-末端尾的包膜糖蛋白结合的调节
I类病毒融合蛋白的C-末端尾部或胞内结构域对于融合功能起作用，而且对于将蛋白质掺入病毒颗粒中起重要的调节作用。结果显示，修饰严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）S蛋白的C末端尾部与增强的包膜糖蛋白并入逆转录病毒假型包装颗粒（Moore e t 。，2004）。修饰包括C-末端尾部截短和HIV-1包膜糖蛋白的一部分细胞质尾部的添加。如果异源病毒包膜糖蛋白无法有效地整合到假型颗粒中，这可能是一个有用的策略。

食谱

500ml完全DMEM（DMEM-C）
440 ml 1×DMEM
50ml 10％FBS（热灭活） 5ml 1x青霉素 - 链霉素（100x） 5ml 10mM HEPES（1M）无菌过滤器DMEM-C通过0.22μm过滤装置
500ml转染DMEM（DMEM-T） 445毫升1×DMEM
50ml 10％FBS（热灭活） 5ml 10mM HEPES（1M）无菌过滤器DMEM-T通过0.22μm过滤装置

致谢

我们感谢Jean Dubuisson提供允许产生假型颗粒的MLV质粒。我们还感谢惠特克实验室的所有成员进行有益的讨论。我们已经成功地使用该协议在几个出版物中产生假型粒子（Sun， 2008; Belouzard e ，2009; Millet and Whittaker，2014; Tse em em>。，in press）。作者实验室的工作由国立卫生研究院（Grant R21 AI111085）资助，也得到国家过敏和传染病研究所，国家卫生研究院的部门全部或部分支持。的健康和人类服务，在流感研究和监测卓越中心（CEIRS）合同号：HHSN272201400005C。

参考文献

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Jaume，M.，Yip，MS，Cheung，CY，Leung，HL，Li，PH，Kien，F.，Dutry，I.，Callendret，B.，Escriou，N.，Altmeyer，R.，Nal，，Daeron，M.，Bruzzone，R。和Peiris，JS（2011）。抗严重急性呼吸综合征冠状病毒穗抗体触发人类免疫通过pH-和半胱氨酸蛋白酶非依赖性FcγR途径转化细胞。 > o l 85（20）：10582-10597。
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