材料和试剂

500ml离心瓶（日立，型号：S305830A）
膜过滤器Millex-GV注射器过滤单元0.22μm（EMD Millipore，目录号：SLGV033RS）
野生型。 merolae 10D细胞（国家环境研究所，日本）
脱落酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4906-250UG）
NaCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-15975）
液氮
乙酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-00256）
二乙醚（Wako Pure Chemical Industries，目录号：052-01165）
甲醇（HPLC级）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：132-06471）
硼酸（H 3 BO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：021-15645）
氯化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：133-00725）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：265-00415）
无水钼酸钠（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：514-30001）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：034-20065）
将硝酸钴（II）六水合物（Co [NO 3] sub 2·6H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：031- 03752）
硫酸铵（[NH 4] 2 Sub SO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：016-03445）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：138-00415）
硫酸（H 2 SO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：195-04706）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：166-04255）
氯化钙（CaCl 2）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：036-00485）
氯化铁（III）六水合物（FeCl 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：090-02802）
Na 2 EDTA（Wako Pure Chemical Industries，目录号：345-01865）
聚乙烯吡咯烷酮K-30（Nacalai tesque，目录号：28314-82）
2,6-二叔丁基对甲酚（东京化成工业，目录号：D0228）
MA2介质（参见配方）
提取溶液（参见配方）

设备

分光光度计（Beckman Coulter，型号：DU730）
冷冻离心机（日立，型号：CF16RXII）
角转子（日立，型号：R10A3）
砂浆和杵
涡旋混合器（M& S Instruments，型号：VORTEX-GENIE 2混合器）
微量离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX150）
带有低温捕集器的真空离心蒸发器（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：CC-105系统）
pH计（As One，型号：KR5E）
装备有光电二极管阵列检测器（PDA）和柱（5μm，4.6×250mm）（Senshu Scientific，型号：ODS SP100）的HPLC系统（Shimadzu，型号：X2 HPLC系统）

程序

萃取
1. C的光密度（OD）。 merolae液体培养物通过分光光度计在750nm测量。当OD 750达到10时，在350ml MA2培养基中稀释细胞以产生约0.5的OD 750值（Kobayashi等人， 2010）。在42℃下用荧光白光（50μM光子m -1 -2s -1 s -1）照射下培养细胞，用补充有2％CO 2的空气鼓泡， 2 。在孵育16小时后，测量OD 750，将培养物转移至500ml离心瓶中，并通过用角转子以3,000xg离心3分钟收集细胞室内温度。轻轻地将沉淀重悬于350ml含有500mM NaCl的MA2培养基中，并在相同条件下进一步培养3小时。
2. 通过在4℃以3,000xg离心3分钟，收获细胞（OD 750 = 0.8，含有约2×10 7个细胞/ml） ℃，通过倾析弃去介质。
3. 通过移液除去剩余的培养基。将颗粒溶解在MA2（1-2ml）中并在液氮中快速冷冻（视频1）
4. 用研钵和研杵将冷冻的细胞悬浮液研磨成粉末（视频1）。
  
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  强>视频1.用于ABA提取步骤A3和A4的视频。此视频支持细胞收获和研磨。
  
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1. 通过涡旋5分钟并在4℃下以10,000×g离心15分钟，使粉末样品在20ml提取溶液中均质化（视频2）。
2. 用0.22μm膜滤器过滤上清液（视频2）。
  
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  视频2.用于ABA提取步骤A5和A6的视频。此视频支持细胞提取和过滤。
  
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1. 在室温下通过真空离心蒸发器浓缩水相（收集约4ml水相）（视频3）。
2. 通过pH计测量水相的pH。用0.5M乙酸调节水相至pH2.8，用0.22μm膜过滤（视频3）
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  strong>视频3.用于ABA提取步骤A7和A8的视频。
  
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1. 通过用5ml二乙醚的三个分配从水相萃取ABA（视频4）。
2. 在室温下通过真空离心蒸发器干燥收集的醚层，并将沉淀溶解在300μl甲醇中（视频4）。
  
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  视频4.用于ABA提取步骤A9和A10的视频。此视频支持提取物的连续纯化。
  
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HPLC分析
1. 在配备有PDA的HPLC系统上进行色谱，使用完全可见光谱，在254nm处进行监测。柱是串联连接的ODS SP100,250×4.6mm，S =5μm。
2. 用50％甲醇进行等度分离。在40℃下的流速为0.5ml/min，并将样品加入10-50μl。在保留时间7.1分钟检测到ABA的峰（图1）。
3. 使用ABA参照在254nm下产生标准校准曲线。
4. 制备浓度为0,10,50,100,200,500,1000pmol /μl的标准ABA，并以10μl应用于HPLC。 HPLC分析应进行三次。
  
  图1.E.C的HPLC分离。 merolae提取物与ABA标准参考。细胞用500mM NaCl处理3小时。通过具有PDA的HPLC分离ABA标准参考和500mM NaCl处理的细胞提取物。显示了0.2mM ABA标准品（左图），500mM NaCl处理的细胞提取物（中心图）和合并（右图）的吸收光谱。

数据分析

记录单个峰面积的保留时间并计算每个峰的平均值。
使用每个峰的平均值创建校准曲线。使用特定的标准校准曲线计算ABA量（示例如图2所示）

图2. ABA标准曲线。基于HPLC分析中的峰值进行标准曲线。实施例：从盐胁迫细胞培养物（350ml，OD 750 = 0.8）开始获得300μl提取物，并将10μl300μl进行HPLC分析，结果读取133.533 AU。基于校准曲线，计算起始材料中所含的ABA的总量为68487.5pmol。

笔记

ABA提取和HPLC方法从Kojima方法修改（Kojima等人，1995）。从C检测ABA。 merolae细胞仅在盐胁迫条件下。

食谱

MA2介质
混合溶液I到III和混乱到1 L.通过高压灭菌消毒。溶液IV应通过0.22微米过滤器过滤灭菌。高压灭菌后将溶液IV加入到混合物中。

解决方案I

解决方案II

解决方案III

解决方案IV

A6次要盐
提取溶液
0.6g/L聚乙烯吡咯烷酮 0.22g/L 2,6-二叔丁基对甲酚
溶于80％（v/v）甲醇中

致谢

该协议改编自Kobayashi等人。（2016年）。作者感谢Tadao Asami博士在ABA检测中的技术帮助。该研究由MEXT/JSPS KAKENHI（批准号：21370015,23120505,2424806,15K14539至K.T.，13274350,15621958至Y.K.）支持，

参考文献

Kobayashi，Y.，Ando，H.，Hanaoka，M.and Tanaka，K。（2016）。脱落酸参与细胞周期启动的控制在单细胞红藻（Cyanidioschyzon merolae）中的血红素稳态。

植物细胞生理学57（5），953-960。
Kobayashi，Y.，Ohnuma，M.，Kuroiwa，T.，Tanaka，K.and Hanaoka，M。（2010）。单细胞红藻的培养和分子遗传分析的基础知识em> Cyanidioschyzon merolae 。 Endocytobiosis Cell Res 20：53-61。
Kojima，K.，Yamada，Y.and Yamamoto，M。（1995）。脱落酸注射对糖和有机酸含量。日本Soc Hort Sci 64（1）：17-21。