材料和试剂

培养皿92×16mm（SARSTEDT，目录号：82.1473）
一次性手术刀（Swann Morton，目录号：0501）
15ml CELLSTAR管（Greiner Bio One，目录号：188261）
50ml CELLSTAR管（Greiner Bio One，目录号：227270）
7ml Bijoux管（Greiner Bio One，目录号：189176）
Fisher Brand TM尼龙网孔滤器，40μm（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：11587522）
0.2μmMinisart NML针筒过滤器（Sartorius Stedim Biotech，目录号：16534-K）
20ml注射器（BD，目录号：300613）
60ml注射器（BD，目录号：309653）
无菌移液管过滤嘴1,000μl（Alpha Laboratories，目录号：ZP1250S）
无菌移液管过滤嘴100μl（Alpha Laboratories，目录号：ZP1200S）
Fisherbrand TM玻璃巴斯德移液管（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：1156-6963）
MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
Wallach Endocell ^®一次性子宫内膜细胞取样器（Wallach Surgical Decices，目录号：908014A）
人体子宫内膜活检（见步骤A）
细胞培养基

（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：31330-038）的DMEM/F12（1：1）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-081）
抗生素/抗真菌剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15240-062）
β-雌二醇（Sigma-Aldrich，目录号：E2758）
重组人胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：91077C）
乙酸，冰醋酸≥99.7％（Sigma-Aldrich，目录号：695092）

组织消化培养基

DMEM/F12，不含苯酚的培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11039-021）
来自溶组织梭菌的胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9891-500MG）
来自牛胰腺的DNA酶I（Roche Diagnostics，目录号：11284932001）

胰蛋白酶-EDTA，0.25％（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：25200-056）
Ficoll-paque plus培养基（GE Healthcare，目录号：17-1440-02）
分离缓冲区（参见配方）

牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Dulbecco A）Oxoid TM（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：BR0014G）

PE抗人SUSD2，克隆：W5C5抗体（Biolegend，目录号：327406）
抗PE微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-048-801）
乙醇，绝对（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10437341）
无菌蒸馏水
葡聚糖包被的木炭（DCC）处理的FBS（参见Recipes）

炭（Sigma-Aldrich，目录号：C9157）
葡聚糖70（Sigma-Aldrich，目录号：1179741）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10500-064）

消化介质（参见配方）
培养基（见配方）

设备

25cm 2的CELLSTAR培养瓶（Greiner Bio One，目录号：690175）。
75格式的培养瓶（Greiner Bio One，目录号：658175）中培养。
5ml血清移液管（Greiner Bio One，目录号：606180）
10ml血清移液管（Greiner Bio One，目录号：607180）
移液器控制器/移液器辅助器（例如，STARLABS，目录号：S7166-0010）
真空驱动0.22μm过滤系统（EMD Millipore，目录号：SCGPT05RE）
LUNA ^TM BF自动细胞计数器（Logos Biosystems，目录号：L10001）
LUNA ^TM细胞计数载玻片（Logos Biosystems，目录号：L12001）
miniMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
MACS多位点（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
Walker II类细胞培养微生物安全柜（Walkers Safety Cabinets，型号：II类MSC）
Fisherbrand FB 70155吸气器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：11533485）
Grant Instruments水浴（Grant Instruments，型号：OLS200）
Thermo Scientific Heacell TM 150i加湿组织培养箱（设定为37℃和5％CO 2）（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026280）。
Sigma 3-16KL台式离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：3-16KL）
亮场Leica DMIL显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DMIL）

程序

收集人体子宫内膜活检
子宫内膜活检是从参加植入诊所，在大学医院考文垂和沃里克郡国家卫生服务信托的专门研究诊所的妇女获得。所有研究都是根据"赫尔辛基宣言"2000年的指南从所有参与者获得完全的伦理批准和书面知情同意。在月经周期的分泌阶段，使用Endocell插管从子宫底部开始进行活检并向下移动到内部宫颈口。将子宫内膜活检置于含有5ml细胞培养基的标记的Bijoux管中，并立即处理。
注意：

活检尺寸根据进行该程序的患者和临床专业人员而有很大的不同。患者的激素状态和其中获得活组织检查的月经周期的阶段将由于子宫内膜的瞬时相位动力学而影响产量和细胞组成。我们的活检定时到月经周期的分泌期，但鼓励读者根据自己的实验假设来定时收集。
通常，活组织检查具有均匀的厚度（参见图1B） 1-6厘米。组织也是脆弱的，并且可能在收集或运输中碎裂，或被血液或粘液污染。读者应该在所有情况下都遵循协议。唯一的例外是当粘液含量超过子宫内膜组织。在这种情况下，丢弃活检。

人类子宫内膜基质细胞（HESCs）的组织消化，分离和培养
注意：确保无菌。在II级微生物安全柜中工作，确保完全无菌技术。
1. 预先准备消化培养基并在水浴中预温至37℃
2. 尽可能多的介质从Bijoux小瓶进入培养皿的盖子，不丢弃组织。将活检和任何剩余的介质转移到培养皿中（图1A）
  
  图1.准备用于消化的子宫内膜活检。在培养基中收集全部活检并立即处理（A）。在使用无菌手术刀（C）向下切割运动5分钟或直到浆状（D）之前，使用手动移液管（B）除去所有培养基。然后将组织片用胶原酶和DNA酶I在37℃消化1小时
3. 使用P1000过滤嘴，手动从组织周围吸出多余的介质（图1B）。
  注意：请勿使用吸气器或有失去组织的危险。
4. 用手术刀用向下攻丝运动至少5分钟（图1C）或直到大块消失并且组织看起来像纸浆一样（图1D）切割组织。
5. 通过一个20毫升注射器和0.2微米的注射器过滤器添加10毫升消化介质到培养皿
6. 使用10ml血清移液管将带有组织碎片的培养基转移到50ml锥形管中
7. 摇动管15秒，并在37℃孵育1小时。以20分钟间隔摇动15秒以帮助消化。
8. 1小时后，加入10ml培养基以中和酶活性，并在室温下以280×g离心管5分钟。
  注意：在此阶段，可以分离上皮细胞（HEEC）（参见步骤C）或血管周围干细胞（参见步骤D）用于单独培养。
9. 离心后，吸出上清液，将细胞沉淀重悬于15ml培养基中，并转移至75cm 2培养瓶中。
  注意：轻轻地倾斜烧瓶以将细胞悬浮液均匀地分布在培养表面上。避免旋转混合，避免将细胞集中在中心。
10. 在37℃，潮湿的5％CO 2环境中孵育
11. 改变培养基，在6-18 h后，以去除血细胞，组织碎片和任何未附着的人类子宫内膜上皮细胞（HEECs）。在显微镜下的检查应该揭示亚汇合基质细胞（图2A）。
  注意：融合将根据活检的大小和质量而有所不同。在这个阶段（也参见图6），可以从上清液中收集免疫细胞，并通过抗原特异性磁性分离或FACS分离免疫细胞，其细节超出了该方案的范围，但是读者可以在其他地方指导（例如，Manaster等et al。，2008; Basu et al。，2009）。
12. 细胞将继续增殖（图2B）直至汇合（图2C）。每隔一天更换培养基，直到传代（见步骤E）或测定。
  注意：
  1. HEEC污染（图2D）应该是最小的，请参考"注释"部分。
  2. 典型的HESC产率根据消化效率，粘液和血液含量以及不同的细胞附着率而显着变化，但它们将与组织的大小和质量相关。作为指导，我们期望从小活检（<1cm）获得1-5×10 5个细胞，对于平均活检获得0.5-1×10 6个细胞（> 4cm）（接种后24小时计数）的大约2-3cm（2-3cm）和1-2×10 6/s。鼓励读者允许细胞在培养物中增殖，直到获得所需的细胞数。
    
    图2.培养的HESC（明视野显微镜） A.HESC培养第一天接种后。 B.接种后的HESC培养第3天。 C.准备好传代或接种的HESCs的汇合培养物。 D.被HEEC污染的HESCs的培养物，在中心呈现为类似螺旋状的细胞群。
分离HEEC
1. 消化后（步骤B8，也参见图6），通过40μm尼龙网孔过滤器过滤细胞溶液。流过将包含基质，红血和免疫细胞，但子宫内膜团块保留在过滤器（图3A）。
2. 使用20ml无添加剂的DMEM/F12培养基反冲洗过滤器，并将腺细胞团块收集在50ml管中（图3B）。
3. 在280×g离心5分钟，室温
4. 吸出上清液并将沉淀物重悬在1ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA中以解离任何团块。腺体团块不能很好地附着于基质，并且在培养基更换期间可能丢失。这个额外的胰蛋白酶 - 解离步骤不同于以前的方案（Chen和Roan，2015），并且通过分散聚集的细胞增加HEEC产量。
5. 在37℃下孵育管10分钟。
6. 加入9毫升的培养基，并通过猛烈吸取上下解离腺体块。将产生HEEC的单细胞溶液。
7. 在280×g离心5分钟，室温
8. 吸出上清液，并根据需要重悬和接种HEEC。
  注意：
  1. HEEC产量将取决于活检尺寸和质量。在步骤C8之后计数的新鲜分离的HEEC通常从小活检（<1cm），3-9×10 5个培养基（2-10cm）产生1-3×10 5个<！ - SIPO 4cm）。但是，鼓励读者允许文化扩散以获得所需的数字。
  2. HEEC的培养需要非标准培养技术，超出本方案的范围。因此，读者被引导到其他地方（例如Chan等人，2004; Defrere等人，2005; MacDonald等人，2007）。
    
    图3.HESC和HEEC的分离和分离。A.组织消化后，收集HESC作为流过40μm细胞过滤器。 B.通过反洗（通过倒置细胞过滤器）收集腺上皮细胞团，并通过胰蛋白酶孵育分散到单细胞HEEC悬浮液中。
子宫内膜血管周围祖细胞间充质干细胞的分离
1. 在步骤B8（也参见图6）之后，吸出上清液并将沉淀重悬于8ml培养基中。
2. 底层4毫升Ficoll-paque到管底部（图4A）。 Ficoll-paque是用于分离红细胞的密度梯度介质。
  注意：离心前有两个不同的层是重要的（图4B）。为了底层Ficoll-paque，填充5毫升血清移液管，但只分配4毫升到管底部，从而避免排出气泡和空气混合。丢弃剩余的1 ml。缓慢地分配4毫升，并将移液器上的速度降低到其最慢的设置。避免在任何时候小心处理混合。不要混用，敲击或反转。
3. 在770×g离心10分钟，室温。红细胞将沉淀，HESC将存在于2层之间的界面内（图4C和4D）。
  
  图4.使用Ficoll-paque分离红细胞。A.缓慢地在被消化的组织下面放4ml Ficoll-paque。 B. 2个不同的层应该是可见的。光盘。离心后，将红细胞沉淀，HESCs和HEEC以及免疫细胞保持在可以收集它们的界面中。
4. 小心吸出大多数上清液，收集包含基质细胞的间期，并转移到15毫升管。
5. 加入8毫升培养基，用移液管充分混合。
6. 通过离心（280×g，5分钟，室温）洗涤不含Ficoll-paque的细胞，吸出上清液并重悬于10ml培养基中。
7. 重复步骤D6两次。
8. 吸出上清液并将细胞沉淀重悬在5ml培养基中，并使用自动细胞计数器或血细胞计数器计数细胞。
9. 在280×g离心5分钟，室温
10. 吸出上清液并将细胞沉淀重悬在含有PE-缀合的W5C5抗体的分离缓冲液（参见Recipes）中。使用100微升分离缓冲液和5微升抗体每10 <支柱> 细胞
11. 充分混合，在黑暗中于4℃孵育20分钟
12. 通过每10 6个细胞加入1ml分离缓冲液洗涤细胞以除去未结合的抗体，并在室温下以280×g离心5分钟。
13. 完全吸出上清液，并重悬细胞沉淀在含有抗PE微珠的分离缓冲液中。使用80μl缓冲液和20μl抗PE微珠每10 <支柱> 细胞。
14. 充分混合，在黑暗中于4℃孵育20分钟
15. 通过每10 6个细胞加入1ml分离缓冲液洗涤细胞，并在室温下以280×g离心5分钟。
16. 完全吸出上清液，并在500μl分离缓冲液中重悬至10μL细胞。
17. 将MACS分离器放在多支架上，将MS柱放在MACS分离器中（图5A）。
18. 用移液管混合细胞悬液，并应用于柱。避免向色谱柱中添加气泡。
19. 收集未标记的细胞，通过加入500μl分离缓冲液洗涤MS柱3次。当色谱柱储液罐为空时，只需添加新鲜的500μl缓冲液。收集总流出物。这是W5C5阴性分数。
20. 从分离器中取出MS柱，并将其置于无菌的15ml管中
21. 立即向柱中加入1ml分离缓冲液，并通过将柱塞牢固地推入柱中来冲洗磁性标记的细胞（图5B）。流通现在将包含W5C5阳性部分。
22. 为了提高磁性标记细胞的纯度，使用新的MS柱对阳性部分重复磁性分离（步骤D18至D21）。
23. 在室温下以280×g离心5分钟
24. 吸出上清液，根据需要重新悬浮细胞沉淀和种子尽管观察到高水平的患者 - 患者变异性，但是分离的W5C5 +细胞通常构成4-8％的基质细胞群体（Murakami等人，2013，）。它们维持了许多间充质干细胞特征（Masuda等人，2012），并且可以培养和分化（Ulrich等人，2014），并使用CFU评估克隆形成（菌落形成单位）测定（Masuda等人，2012; Murakami等人，2013; 2014）。
  
  图5.子宫内膜血管周围祖细胞间充质干样细胞的磁性分离在W5C5 +细胞的抗体标记后（步骤D9-D15），重力进料细胞悬浮液柱在磁性支架。流过物将是负标记的级分（A）。从磁性架中取出柱，并通过立即添加1ml分离缓冲液并通过柱塞（B）排出，冲洗W5C5阳性标记的细胞。这些步骤可以使用新鲜的MS柱以正离子馏分重复，以提高纯度
  
  图6.在人子宫内膜活检中分离不同细胞类型的工作流程
HESCs通过
1. 通道细胞在80-90％汇合（参见图2C）
2. 预热培养基，无菌PBS和0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃水浴中
3. 从培养瓶中吸出培养基。
4. 加入10 ml PBS，冲洗细胞单层，吸出
5. 加入2毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，倾斜烧瓶以确保溶液覆盖整个表面，并返回到孵育器2-3分钟或直到细胞已经脱落。
  注意：通过轻轻摇动烧瓶并在光学显微镜下检查，可以松开细胞。
6. 向烧瓶中加入8ml培养基以中和胰蛋白酶，并在培养瓶底部重复吸取培养基以洗涤剩余的细胞。
7. 将细胞悬液转移到15ml管中，在280×g，室温下离心5分钟。
8. 在9ml培养基中重悬浮沉淀，并将3ml种子种入含有12ml培养基的新的75cm 2培养瓶中。为了维持培养，细胞通常以1:3的比例分开，但在此阶段可以接种到适于所需实验的塑料制品中。

笔记

当制备DCC-FBS时，真空过滤停止
1. 过滤装置容易堵塞。避免从管的底部吸入木炭。
2. 更换过滤系统。有时，需要两次过滤器更换才能完成全过滤。
文化受上皮细胞污染（见图2D）
1. 活检消化后（步骤B8）使用40μm细胞过滤器过滤溶液。基质细胞通过过滤器，大部分腺体保留
2. 首先更换介质（3至6小时）。大多数基质细胞，但很少上皮 Manuel，I.，Mizrahi，S.，Goldman-Wohl，D.，Sela，HY，Stern-Ginossar，N.，Lankry，D.，Gruda，R.，Hurwitz，A.，Bdolah，Y.，Haimov- Kochman，R.，Yagel，S.和Mandelboim，O。（2008）。子宫内膜NK细胞是等待怀孕的特殊不成熟细胞。 181（3）：1869-1876。
3. Masuda，H.，Anwar，SS，Buhring，HJ，Rao，JRand Gargett，CE（2012）。人类子宫内膜间充质干细胞样细胞的新型标记物细胞移植 21（10）：2201-2214。
4. Murakami，K.，Bhandari，H.，Lucas，ES，Takeda，S.，Gargett，CE，Quenby，S.，Brosens，JJand Tan，BK（2013）。在生殖系统衰竭的肥胖女性中，clonogenic子宫内膜间充质干细胞缺乏 - 一项试点研究。 PLoS One 8（12）：e82582。
5. Ulrich，D.，Tan，KS，Deane，J.，Schwab，K.，Cheong，A.，Rosamilia，A.and Gargett，CE（2014）。绝经后子宫内膜中的间充质干/间质细胞 Hum Reprod 29 9）：1895-1905