材料和试剂

注意：整个方法使用无菌无热原的培养皿和板，移液管，吸头，微量离心管和锥形管进行。所有介质和缓冲液需要通过0.22μm过滤器过滤。

培养皿，145×20mm（Greiner Bio One，目录号：639161）
2 ml管
15ml离心管
U底96孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353077）
V底96孔培养板（Corning，Falcon ，目录号：353263）
2ml无菌注射器（Henke Sass Wolf，目录号：4020.000V0）
22G无菌针，0.7×40mm（Terumo Europe，目录号：NN-2238R）
小鼠：C57BL/6J（Janvier Labs）
颗粒：直径3μm的胺改性聚苯乙烯微球（Polysciences，目录号：17145-5）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水，无钙，无镁（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibico ^{TM，目录号：14190094）}
戊二醛，25％（vol/vol），EM级（Electron Microscopy Sciences，目录号：16220）
低内毒素卵清蛋白（OVA）（Worthington Biochemical，目录号：LS003062）
甘氨酸，0.5M的PBS（Biosolve，目录号：07132391）
CO 2独立培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：18045088）。
Glutamax补充物（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050061）
Iscove改良的Dulbecco培养基（IMDM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31980030）
低内毒素胎牛血清（FBS，在56℃热灭活20分钟）（Biowest，目录号：S1860）
β-巯基乙醇（50mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31350010）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
抗鸡卵清蛋白（OVA抗体）（Sigma-Aldrich，目录号：C6534）
纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体（Fc区）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553142）
抗小鼠LAMP-1抗体，生物素偶联物（Affymetrix，eBioscience，目录号：13-1071-82）
山羊抗兔IgG（H + L）抗体，DyLight 633缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：35562）}
山羊抗兔IgG（H + L）抗体，Alexa Fluor 568缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A11036）}
链霉亲和素，Alexa Fluor？488缀合物（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：S11223）}
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I-0250）
蔗糖（EMD Millipore，目录号：107651）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P-7626）
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11873580001）
二硫苏糖醇（DTT）（EMD Millipore，目录号：233155）
台盼蓝溶液，0.4％（wt/vol）（MP Biomedicals，目录号：0916910）
内部化媒介（见配方）
BMDC培养基（见配方）
均质缓冲液（参见配方）

设备

涡流
用于2ml，15ml和50ml大小的管以及96孔板的冷冻离心机
将调节至37℃和5％CO 2 的组织培养孵育器
Stuart试管旋转轮耐受4°C（Bibby Scientific，型号：SB3）
温控水浴
邮递
组织培养光学显微镜配备明场和20倍物镜
多通道移液器
LSR II流式细胞仪（BD）或任何其他多色流式细胞仪

软件

FlowJo软件（FlowJo，LLC。）
Prism 6软件（GraphPad Software，Inc。）

程序

抗原偶联颗粒的制备
注意：估计将用于该测定的细胞数，以预先在实验前一天制备足够量的与OVA偶联的颗粒。 3μm微球的原料悬浮液含有1.68×10 9颗粒/ml。
实施例：基于培养物中的培养皿的量估计要收获的细胞的量（例如，从四个145mm的BMDC培养皿中总共20×10 6个细胞）。将该数乘以10（每个细胞提供的珠的量），并除以珠的浓度（1.68×10 9个/ml颗粒）。
1. 彻底将胺改性的聚苯乙烯微球的涡旋悬浮液并分配到2ml管（最大200μl/管）中
2. 向每个管中加入1.6ml PBS，在4℃下以16,000×g旋转并旋转3分钟。
3. 弃去上清液，将沉淀重悬于1.8ml PBS中并涡旋。再次旋转。
4. 弃去上清液，并在8％戊二醛/PBS（vol/vol）中重悬沉淀。使用五倍体积的珠，其最初使用（例如，在1ml中200μl）。
5. 涡旋并将所有悬浮液混合在15ml离心管中。保护管不受光，并在试管旋转器上在室温下以20rpm孵育4小时
6. 将悬浮液转移回2ml管中，并在4℃下以16,000×g旋转3分钟。
7. 弃去上清液，在1.8ml PBS中重悬和涡流沉淀。再次旋转。
8. 弃去上清液并在0.5mg/ml OVA/PBS中重悬沉淀物（使用最初使用的5倍体积的珠子[例如，在1ml中200μl]）。
9. 涡旋并将所有悬浮液混合在15ml离心管中。在试管旋转器上在4℃下以20rpm孵育过夜
10. 将悬浮液转移回2ml管中，并在4℃下以16,000×g旋转3分钟。
11. 弃去上清液，在1.8ml 0.5M甘氨酸/PBS中重悬和涡旋沉淀
12. 在试管旋转器上以20rpm在4℃下孵育30分钟
13. 在4℃下以16,000×g离心3分钟。
14. 弃去上清液，在1.8ml PBS中重悬和涡流沉淀
15. 重复旋转，然后用1.8ml PBS再洗涤两次（总共三次洗涤）
16. 在初始体积（200μl）中重悬每个沉淀，汇集并涡旋分散体。将OVA偶联的微球的悬浮液储存在4℃ 注意：偶联的微球应在流式细胞器测定实验前一天新鲜制备，并且在4℃储存时可在一周内使用。切勿冻结颗粒，并经常仔细涡旋分散，以避免偶联的微球聚集
抗原偶联颗粒的吞噬作用
注意：对于每个实验条件，估计大约5 x 10 ^6个单元格。
1. 通过用移液管重悬细胞簇和单细胞。在4℃下以400×g离心细胞4分钟。
2. 在冰冷的PBS中重悬细胞，并在4℃下以400×g离心4分钟。
3. 在冰冷的内化培养基中重悬细胞，将其转移到锥形15ml离心管中并计数细胞。
4. 在冰冷的内化培养基中将细胞悬浮液调节至20×10 6个/ml的细胞密度，并将其保持在冰上。
5. OVA偶联的微球的涡旋悬浮液，并将它们以10：1的颗粒与细胞比率添加至细胞。小心混合。
6. 在调节至16℃的水浴中孵育样品30分钟。如有必要，在孵化期间向水浴中加入冰
7. 将样品置于冰上，向管中加入10ml冰冷的PBS。吸移上下，关闭管，并彻底摇动他们10秒。在4℃下以100×g离心4分钟以除去浮动颗粒
8. 弃去上清液，重复最后一步两次，共进行三次洗涤
9. 将每个细胞沉淀重悬在预热的BMDC培养基中，并将细胞悬浮液在15ml离心管中，以允许吞噬体的抗原降解发生在不同的时间点。每个实验条件使用1-2毫升培养基。
10. 向一个管中加入10ml冰冷的PBS，这表示0分钟的时间点。将此管保持在冰上。
11. 保持其他管开放，并在37℃和5％CO 2下孵育不同的追踪期（例如：60和120分钟）。
12. 停止每个追逐期，加入10毫升冰冷的PBS，并保持这些管在冰上
手动裂解和标记样品
注意：吞噬吞噬颗粒后，细胞经历标记步骤，区分表面结合颗粒与内化的颗粒。随后，手动裂解细胞以释放细胞质和细胞器，然后进行标记步骤以检测吞噬体OVA的水平以及在吞噬体成熟期间获得溶酶体标记物（例如，LAMP-1）至吞噬体。
1. 在4℃下，在400×g下旋转所有管4分钟。
2. 弃去上清液，并在PBS + 1％（wt/vol）BSA中重悬每个沉淀。将样品转移到U底96孔板。
3. 在4℃下以400×g离心该板4分钟，并轻轻上清液。
4. 将每个样品重悬于0.2ml PBS + 1％（wt/vol）BSA + 1:100稀释的CD16/CD32抗体（Fc块）中。在冰上孵育10分钟。
5. 在4℃下在400×g下旋转平板4分钟，并轻轻上清。
6. 将每个样品重悬于0.2ml PBS + 1％（wt/vol）BSA + 1:500稀释的OVA抗体中。在冰上孵育15分钟。
7. 在4℃下，在400×g下旋转板4分钟，并轻轻上清。
8. 将每个样品重悬于0.2ml PBS中，并在4℃下以400×g离心该板4分钟。轻轻上清液并重复洗涤。
9. 将每个样品重悬于0.2ml PBS + 1％（wt/vol）BSA + 1：1,000稀释的抗兔Alexa Fluor 568中。在冰上孵育15分钟。
10. 在4℃下在400×g下旋转板4分钟，并轻轻上清。
11. 将每个样品重悬于0.2ml PBS中，并在4℃下以400×g离心该板4分钟。轻轻上清液并重复洗涤。
12. 将样品转移到锥形1.5ml离心管中，并在4℃下以400×g离心4分钟。
13. 小心吸出上清液，并将每个细胞沉淀重悬在0.5ml匀浆缓冲液中
14. 对于细胞的机械裂解，将悬浮液彻底通过装配至2ml注射器的22G针头15次。使用注射器的整个体积机械破碎细胞。通过台盼蓝染色（图1）控制匀浆成功：将1μl样品加入到9μl0.4％（wt/vol）台盼蓝溶液中，混合并加入细胞培养计数室。使用光学显微镜计数未染色的完整细胞以及染色的裂解细胞的量。计算裂解细胞的百分比，不超过裂解细胞的80％。此外，避免破坏细胞核。
  
  图1.在吸收OVA偶联的珠粒以释放吞噬体用于随后的流式细胞器血细胞计数之后的BMDC的机械裂解。使BMDC内化OVA偶联的珠子30分钟，随后为追踪期以允许吞噬体成熟发生。为了机械破碎细胞以释放完整的吞噬体而不破坏细胞核，我们将细胞悬浮液通过22G针15次。该图显示了在（上图）和细胞裂解后（下图）用台盼蓝标记的细胞悬浮液。在细胞膜破碎但细胞核完整（箭头）的细胞中积累的台盼蓝允许人们监测机械细胞裂解的成功。通过明视野显微镜观察获得的后核上清液（PNS）中吞噬体的释放。标尺=20μm。
15. 在4℃下在150×g下旋转管4分钟，以将细胞核上清液（PNS）与细胞核分离并保留完整的细胞。
16. 将不同样品的PNS转移到V型底96孔板中并保存在冰上
17. 在4℃下以1,500×g离心该板3分钟，并用多通道移液管除去上清液。
18. 加入50μlPBS + 1％（wt/vol）BSA + 1:500稀释的OVA抗体+ 1:100稀释的LAMP-1抗体。
19. 用多通道移液器混合样品，密封板并在冰上孵育过夜。
20. 向每个孔中加入0.15ml PBS + 0.1％（wt/vol）BSA，在4℃下以1,500xg离心该板3分钟，并用多通道移液管除去上清液。 >
21. 加入0.2ml PBS + 0.1％（wt/vol）BSA，并用多通道移液器混合样品
22. 再次旋转板，并再次用PBS + 0.1％（wt/vol）BSA重复洗涤。
23. 用多通道移液管除去上清液后，加入50μlPBS + 1％（wt/vol）BSA + 1：1,000稀释的抗兔DyLight 633 + 1：1,000稀释的链霉亲和素Alexa Fluor 488.在冰上孵育45分钟min。
24. 向每个孔中加入0.15ml PBS + 0.1％（wt/vol）BSA，在4℃下以1,500xg离心该板3分钟，并用多通道移液管除去上清液。 >
25. 加入0.2ml PBS + 0.1％（wt/vol）BSA，并用多通道移液管混合样品
26. 再次旋转板，并再次用PBS + 0.1％（wt/vol）BSA重复洗涤将每个样品重悬在0.2ml PBS中，并将板保持在冰上，直到通过流式细胞术测量。在同一天测量非固定状态的样品。

数据分析

注意：在含有吞噬体的PNS已经标记OVA和LAMP-1之后，通过流式细胞器细胞计数法分析以确定抗原降解的动力学（在给定时间点的吞噬体OVA的水平）和溶酶体标记物（例如，LAMP-1）的获得。由于含微球体吞噬体的物理性质和特定大小，可以应用门控策略以同时测量这些参数。

通过多色流式细胞术测量样品并应用以下门控策略：

通过单独测量OVA耦合珠确定PNS中珠和吞噬体的总体，并对样品应用类似的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设置。在单个粒子群上设置一个门（图2A）。
从随后的分析中排除表面结合的珠（在手动裂解前标记的）。只包括吞噬体，通过应用第二个门（图2B），抗兔Alexa 568检测到的OVA为阴性。
门控群体包含单个吞噬体，其可以通过绘制OVA的直方图（通过抗兔DyLight 633检测）和LAMP-1的直方图，同时分析（图2C）或单独（图2D），随时间分析OVA降解和LAMP- 1（通过链霉亲和素Alexa Fluor 488检测）注意：根据应用的抗体标记荧光团和使用的流式细胞仪，可能需要在不同通道之间进行补偿。

使用FlowJo软件（FlowJo，LLC。）进行流式细胞术数据的分析。使用Prism 6软件（GraphPad Software，Inc。）进行统计分析。每个单个实验需要通过足够数量的独立实验（至少一式三份）重复，以从流式细胞器细胞计数分析中得出结论。图2所示的数据代表至少三个独立实验

图2. DC吞噬体的所应用的流式细胞器细胞计数分析的门控策略。使LPS处理的BMDC在16℃下内化OVA包被的珠，并孵育不同的追踪期（0分钟，60分钟，120分钟），以允许吞噬体成熟。表面结合的，非内化的珠子用抗OVA和Alexa 568偶联的二抗染色。随后，将细胞机械裂解以释放包括含有珠的吞噬体的核上清液（PNS）。 PNS对于OVA（通过DyLight 633偶联的第二抗体检测）和LAMP-1（通过Alexa 488偶联的第二抗体检测）染色，并通过流式细胞术同时分析。 A.使用标记的PNS的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）设置，将第一个门设置在单个珠和单个含珠的吞噬体上。 B.在第二个门中，从含珠的吞噬体中分离非内化珠（对Alexa 568是阳性的）（Alexa 568阴性）。 C.通过在成熟的OVA（Dylight 633） - 阴性和LAMP-1（Alexa 488）阳性群体上应用第三个门，同时分析噬菌粒以降解OVA和获得LAMP-1。 D.或者，吞噬体成熟的这两个参数也可以单独分析和随时间量化

笔记

BMDC由含有GM-CSF的培养基中的分离的鼠骨髓祖细胞产生9天。在实验当天，CD11c的细胞表面表达应始终超过85％
结果的重现性高度依赖于机械破碎和细胞裂解期间的同质条件。始终通过台盼蓝染色控制细胞裂解的成功。另一个因素是使用的细胞的吞噬效率。始终计数您的样品的细胞数量，以应用相当的珠 - 细胞比率珠收购。不要超过这个比例，因为大量的内化颗粒会诱导细胞死亡，并影响流式细胞仪测量的参数。
虽然OVA耦合颗粒在这里用作吞噬模型系统，其他配体可以应用在珠偶联期间调查受体 - 配体相互作用对吞噬体成熟的影响。一些例子在别处公开（Hoffmann等人，2010; Hoffmann等人，2012）。

食谱

内部化媒介
CO 2独立介质
1x glutamax补充剂
BMDC培养基
IMDM
10％（vol/vol）FBS
50μMβ-巯基乙醇 100 IU/ml青霉素
100μg/ml链霉素来自J558浆细胞瘤细胞的10％（vol/vol）上清液，其用作GM-CSF来源（Winzler等人，1997）
均匀化缓冲液
3mM咪唑，pH7.4 250mM蔗糖 2mM PMSF
1x蛋白酶抑制剂混合物
2 mM DTT

致谢

这项工作由法国国家研究机构通过"未来投资"计划（法国生物成像，ANR-10-INSB-04），ANR-11-LABX-0043和CelTisPhyBio Labex（N-ANR- 10-LBX-0038），IDEX PSL的一部分（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）。我们感谢欧洲研究委员会（2013-AdG No.340046 DCBIOX），La Ligue Nationale contrele Cancer（EL2014.LNCC/SA），Fonds Wetenschappelijk Onderzoek（FWO; 1526615N; 11W8415N）的资金支持， EMBO长期奖学金（ALTF 883-2011）以及Fondation RechercheMédicale奖学金（SPF20101221176）和omics @ VIB课程（由Marie Curie FP7 People Cofund共同资助）。
这里描述的协议是基于我们实验室以前发表的协议（Savina等人，2010），其被进一步开发以测量树突状细胞和巨噬细胞中的不同吞噬体成熟参数。

参考文献

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Flannagan，RS，Jaumouille，V.和Grinstein，S.（2012）。吞噬作用的细胞生物学 7：61-98。

Hoffmann，E.，Kotsias，F.，Visentin，G.，Bruhns，P.，Savina，A.和Amigorena，S。（2012）。树突状细胞中的自主吞噬体降解和抗原呈递。美国国家科学院院报109（36））：14556-14561。

Hoffmann，E.，Marion，S.，Mishra，BB，John，M.，Kratzke，R.，Ahmad，SF，Holzer，D.，Anand，PK，Weiss，DG，Griffiths，G。和Kuznetsov，SA 2010）。初始受体 - 配体相互作用调节基因表达和吞噬作用的早期和晚期阶段的吞噬体性质。 Eur J Cell Biol 89（9）：693-704。

Kinchen，JM和Ravichandran，KS（2008）。 Phagocytosis and antigen presentation in dendritic cells。 Immunol Rev 219：143-156。

Savina，A.，Vargas，P.，Guermonprez，P.，Lennon，AM和Amigorena，S。（2010）。