材料和试剂

Nunc 96孔黑色底板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：137101）
Eppendorf管
15和50ml锥形管
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7528）
HEPES（1μM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-080）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S233-500）
4-羟基苯基乙酸（pHPA）（Sigma-Aldrich，目录号：H50004）
HRP（Sigma-Aldrich，目录号：P8125）
（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：14175-095）的H 2 SO 4/Ca 2+ /酚/Mg 2+ br />
α-酮戊二酸（Sigma-Aldrich，目录号：K2000）
过氧化氢溶液（H 2 O 2 sub）（30％，w/w）（Sigma-Aldrich，目录号：H1009）
Tris
EDTA，
蔗糖
蛋白酶抑制剂片剂（Sigma-Aldrich，目录号：11836170001）
磷酸酶抑制剂（EMD Millipore，目录号：524625）
抗霉素A（可选）
MitoTempo（可选）
pHPA缓冲液（参见配方）
1mM H 2 O 2工作原液（参见配方）
线粒体缓冲液（见配方）

设备

程序

样品可以是全细胞，新鲜分离的线粒体或来自各种细胞类型（即巨噬细胞，成纤维细胞，支气管肺泡灌洗细胞等）的膜级分。
线粒体隔离：
1）在（100μl）线粒体缓冲液中溶解1000万巨噬细胞（参见Recipes）。使用Kontes Pellet Pestle Motor进行30秒的裂解以均质化每个样品 2）在4℃下以2,000xg离心10分钟，在4℃下保存上清液。
3）将沉淀裂解并离心[重复步骤1）和2）] 4）将两种上清液合并，并在4℃下以12,000xg离心15分钟。
5）将沉淀物重悬于不含蔗糖（与1中相同）的（50μl）线粒体缓冲液中，但不添加蔗糖]。

数据分析

使用标准的初始读数生成标准曲线。
通过对标准曲线和外推进行线性回归来确定样品中的H 2 O 2 O 2浓度。
将样品标准化为蛋白质或细胞数。样品可以在蛋白质样品缓冲液中裂解以确定细胞蛋白质水平，或者当使用活细胞时，可以使用细胞数量来标准化数据。
数据可以表示为在设定时间内的速率（图2A）或通过显示动力学曲线（图2B）;也见2016年Larson-Casey等人。

图2.表达空的或组成型活性的Akt1（Akt1 CA）表达载体的巨噬细胞中的线粒体H 2 O 2 O 2代 >

笔记

食谱

pHPA缓冲液
在Ca 2+ 2+/Mg 2+ 2+ /无酚红的HBSS中制备的总体积为50ml。
在50 ml锥形管中补充缓冲液，避光
1mM H 2 O 2工作原液溶液
1.13μl30％（w/w）H 2 2 O 2储备溶液/10ml H 2 O 2 / 注意：H _{_{> MW = 84.01,30％（w/w）（H 2} O _em> stock solution）相当于8.82M。}
线粒体缓冲液
10mM Tris，pH7.8 0.2 mM EDTA
320mM蔗糖 1蛋白酶抑制剂片剂
磷酸酶抑制剂稀释1：100

致谢

这项工作由2R01ES015981& VA优点评论BX001135。该协议最初是从Panus等人修改的。（1993）。

参考文献