材料和试剂

1.5ml Eppendorf管（Eppendorf）
950×150mm培养皿（山海五一玻璃厂，目录号：1771）
无菌移液器吸头（Corning，Axygen ^®）
Parafilm（Bemis，目录号：PM-996）
铝箔（GLAD，目录号：F5M）
0.2微米注射器过滤器（Pall，Acrodisc ，目录号：4554）
拟南芥种子
Murashige和Skoog基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
琼脂（MBCHEM，目录号：170837，由WHIGA在中国代理）
蔗糖，纯度：AR（天津大美化学试剂厂，目录号：57-50-1）
赤霉酸（GA 3）（Sigma-Aldrich，目录号：G7645）
乙醇，纯度：AR（天津大高化学试剂厂，目录号：64-17-5）
氢氧化钾（KOH），纯度：AR（成都化学试剂研究所，目录号：1310-73-2）
MS固体培养基（参见配方）
10mM GA ₃原料（见配方）
70％乙醇（见配方）
1％次氯酸钠（参见配方）
高压蒸馏水（见配方）

设备

Aquapro水净化系统（Aquapro，型号：AQ06062001）
注意：此产品已停产。
冰箱（海尔，型号：BCD-648WDBE）
高压灭菌器（HIRAYAMA，型号：HVE-50）
1ml移液管（Eppendorf，目录号：3120620.001）
干燥炉（ZenithLabo，型号：DHG 9070A）
100ml烧瓶中
微波炉（Galanz，型号：G70F20N2L-DG）
Bechtop（苏州安泰空气技术，型号：SW-CJ-1FD）
立体显微镜（尼康，型号：SMZ1500）
数码相机（10兆像素）（尼康，型号：COOLPIX4500）
温度计（中国吴强）

软件

Photoshop CS5软件
IBM SPSS Statistics 22软件
Origin8.0软件或Microsoft Excel

程序

准备：本协议中使用的所有试剂均应无菌（参见配方中的详细信息）。通过高压灭菌（121℃，20分钟）灭菌1.5ml Eppendorf管，培养皿和1ml移液管吸头。将干燥的无菌材料在37℃的干燥炉中过夜。
制备具有或不具有GA 3的固体MS培养基平板：使用微波炉彻底熔化固体MS培养基（两个烧瓶，每个具有100ml），然后将烧瓶冷却至50-60℃。在一个烧瓶中制备1μMGA 3溶液（10mM GA 3的储备溶液），彻底但轻轻地混合培养基，然后倒入四个板中。没有添加GA 3将另一瓶培养基倒入另外四个板中。冷却后，使用Parafilm密封所有的板，使用前保存在4°C 注意：

在此步骤中，半介质是可选的。
在添加GA ₃储备溶液之前，必须冷却介质。
在进行实验之前，可以制备培养基并保持在4℃。但是，GA ₃的培养基应保存在黑暗中，并在一周内使用。
的浓度可以根据实验需要进行调整。

收集大约200个成熟的种子放入1.5毫升的Eppendorf管。
在净化台消毒种子：向含有种子的管中加入500μl70％（v/v）乙醇，并剧烈反转几次。 3分钟后，弃去乙醇，加入1ml 1％（v/v）次氯酸钠，在10分钟内倒置几次。最后，用无菌蒸馏水冲洗种子四或五次。
注意：请确保灭菌种子的时间不超过3分钟乙醇和10分钟次氯酸钠。
播种：将种子重悬于约100μl水中，然后使用移液管转移至培养基中。转移时，确保种子分开，不要相互接触。每次处理至少播种80粒种子。让板开得足够长，这样种子周围和介质表面上的过量水可以蒸发。包装板在铝箔保持黑暗。
分层：将所有板在4℃保持2或3天。
注意：确保分层温度为4°C。较高的温度会加速种子在暴露于光之前的发芽。
分层后，将培养基平板放入培养室（22℃，16小时光照/8小时黑暗光周期，由冷和暖白色荧光灯提供的光，光强度约100μmol/m 2 s ^-1，相对湿度为75％-80％）。
注意：

确保培养温度为22°C，并且应在架子表面上保存温度计。高温会影响种子发芽。
确保所有介质板都应用相同的光强度。由于单个灯泡的光强度变化，板材应保持在较窄的范围内。

数据记录：当种子暴露于光时标记0小时。使用立体显微镜（5x放大）每2小时拍摄每个板的照片，直到所有种子都发芽（参见图1）。数据应根据至少三次独立实验计算，结果类似。
注意：在根尖提示后计数种子萌发是可选的（参见图1，右图），其被定义为种子萌芽的第一个标志。每2小时对种子进行评分，直到种子发芽率达到98％以上

图1.拟南芥的种子萌发过程。图像显示在正常条件下种子外壳和胚乳破裂期间种子的状态。在种皮破裂（中）或胚乳破裂（右）之前（左）或之后拍摄照片。种子衣，胚乳和胚根用黑色箭头表示

数据分析

使用Photoshop CS5软件，计数在每个时间点具有破裂的睾丸或胚乳的种子的数量。发芽率由具有破裂的胚乳的种子的百分比相比于种子的总数来指示。此外，睾丸破裂的速率由具有破裂的睾丸的种子的百分比与种子的总数相比来指示（任选的）。使用IBM SPSS Statistics 22软件分析发芽率和试验破裂率。通过单因素方差分析（ANOVA）分析与对照种子（* P <0.05，** P <0.01）比较的显着差异。种子发芽的线图通过使用Origin8.0软件或Microsoft Excel进行。

笔记

从种子灭菌的步骤，所有的操作必须在干净的工作台上进行。

食谱

100ml MS固体培养基
0.44g Murashige和Skoog基础培养基粉末
1克蔗糖
溶于90ml ddH 2 O中并用KOH调节pH至5.8-5.9。用ddH 2 O/b/b使体积为100ml 加入0.8g琼脂粉末并在121℃下高压灭菌20分钟
10ml 10mM GA 3原料
34.638mg GA 3粉末
溶于10ml无水乙醇中，用0.2μm过滤器在干净的平台上过滤分装到无菌的1.5 ml Eppendorf管中用铝箔覆盖管，以防止光照，存储在-20°C
100ml 70％乙醇
70毫升无水乙醇用ddH 2 O/b/b使体积为100ml
7ml 1％次氯酸钠
1ml 7％次氯酸钠
用ddH 2 O 2将体积调至7ml
灭菌蒸馏水
121℃，20分钟高压灭菌蒸馏水

致谢

这个协议改编自华南师范大学的晓静王实验室。这项工作得到了中国国家自然科学基金会（授予No. 90917011，X.W.）的支持。我们感谢craig schluttenhofer博士（肯塔基大学）校对这篇文章。

参考文献

中国科技大学学报（自然科学版)refrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefrefref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ref ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26400990"target ="_ blank">赤霉酸刺激的拟南芥6在种子发芽期间作为赤霉素，脱落酸和葡萄糖信号传导的整合子>拟南芥。植物生理学 169（3）：2288-2303。