材料和试剂

50ml锥形管
1.5 ml微量离心管
铝箔
石蜡膜（Sigma-Aldrich，目录号：P-7793）
无绒纸
1.5ml蛋白LoBind管（Eppendorf，目录号：0030108116）
玻璃显微镜载玻片
玻璃显微镜盖玻片
Nicotiana tabacum （Hanson和Köhler，2001）
16％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
叠氮化钠（NaN 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S-2002）
0.005％NaN 3在PBS（N 3 PBS）中的溶液
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-9284）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS，高压灭菌）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，，21600-010）
0.1％Triton X-100的PBS（PBST）
Vaseline（Unilever，VASELINE ^®）
BluTack（Bostic）
Rubisco抗体（兔）（礼品 - Spencer Whitney，Whitney和Andrews，2001）
Cy5二级AB（抗-rab）（Abcam，目录号：Ab6564）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号：P-4864）
Calcofluor白（Sigma-Aldrich，目录号：F-3543）
40％丙烯酰胺（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0140）
2％双丙烯酰胺（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0142）
VA-044引发剂（Wako Pure Chemical Industries，目录号：017-19362）
去离子和蒸馏水（ddH 2 O）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L-3771）
硼酸（H 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B-6768）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S-8045）
α-淀粉酶（Megazyme，目录号：E-ANAAM）
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（Megazyme，目录号：E-ABFCJ）
β-甘露聚糖酶（Megazyme，目录号：E-BMACJ）
纤维素酶（Megazyme，目录号：E-CELBA）
果胶裂解酶（Megazyme，目录号：E-PLYCJ）
木葡聚糖酶（Megazyme，目录号：E-XEGP）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C-5670）
水凝胶溶液（200ml）（参见配方）
SDS清除溶液（1 L）（参见配方）
酶处理溶液（10ml）（见配方）

注意：

在进行多聚甲醛（PFA），丙烯酰胺，十二烷基硫酸钠（SDS）和叠氮化钠（NaN3）是已知的刺激剂，敏化剂，致癌物质和神经毒素之前，请参考MSDS。在实施此协议时，必须使用个人防护设备（PPE）。
任何特定的IgG一级抗体和各自的二级抗体可用于该方案。
可以暂停协议并且将样品从步骤D开始的任何阶段存储在SDS清除溶液或N <

设备

真空泵在-100 kPa
通风橱
4°C冰箱
37°C水浴
权衡余额
37℃恒温摇床
Leica SP8共聚焦显微镜/lightheet显微镜或等同物
长工作距离目标大于2毫米

软件

Leica应用套件 - 荧光（LAS-AF）软件

程序

植物收获
1. 在黑暗期结束时收获成熟，完全扩展的叶子，以最小化淀粉积累。根据实验设计，在切除的椎间盘叶中的复制和位置将不同
固定
1. Excise〜20 em。 tabacum从完全膨胀叶片的每条线的7mm叶片，然后立即将每个样品放入含有冰冷水凝胶溶液的单个50ml锥形管中。如果样品需要单独分离，则对每个样品使用1.5 ml试管
2. 如果存在荧光团以便于水凝胶渗透和除去气体，将组织置于-100kPa（通风橱中）的真空下在冰上和黑暗中放置1-2小时。
3. 转移至4°C冰箱过夜。
  注意：如果存在荧光团，则在整个方案中将样品保存在黑暗中，即用铝箔包裹试管。
水凝胶聚合（图1.1）
1. 小心地从50毫升锥形管中删除单个叶盘，并将单个磁盘放入1.5毫升微量离心管，含有1毫升新鲜的冷冻水凝胶溶液，并保持在冰上。
2. 将样品在真空下放置15分钟，以除去样品转移过量的气体。
3. 用水凝胶溶液完全填充1.5 ml管，注意在用石蜡密封前除去任何气泡
4. 将密封的管在37℃水浴中过夜漂浮聚合
组织清除（图1.2）
1. 从1.5 ml管中取出聚合的叶盘，并用无绒纸小心地从样品中分离过量的水凝胶（见下面的注释）。
2. 洗涤样品在单独的50毫升锥形管的SDS清除溶液，并改变3次，每天2天，以去除过量未绑定的PFA和丙烯酰胺在室温。注意正确处理此解决方案。
3. 在37℃下，在非常温和的搅拌下，在每个管中每天更换50ml SDS清除溶液4-6周（或直到透明）。
  注意：通过将样品放置在无绒纸的干净区域上并且缓慢拉开，剥离多余的水凝胶。重复此过程，直到所有过量的水凝胶从叶盘的表面去除。在这个阶段，样品是相当坚固的，甚至垂直毛发分娩后，如果仔细完成，在去除多余的水凝胶后仍会保留。
酶处理（图1.3）
1. 在50ml Nil 3 PBS（参见材料和试剂部分）中广泛洗涤样品，每天3次，在室温下3天。
  注意：SDS是酶活性的抑制剂，不当的洗涤将导致细胞壁的酶不完全降解。
2. 将单个样品转移到含有1ml酶混合物（[EM]，参见材料和试剂部分）的1.5ml蛋白LoBind管中，并在非常温和的搅拌下在37℃保持5-7天。
  1. 在酶处理期间，-100kPa的真空以3×5分钟的爆发施用，每天3次，以帮助促进酶渗透。
  2. 第三天用新鲜的EM替代溶液。
3. 5-7天后小心取出样品，然后在24小时内用温和搅拌，在50ml PBST中用三次更换洗涤。
免疫定位
1. 在PBST中稀释初级/次级抗体至所需浓度。
  1. 将样品转移到1.5 ml含有1 ml所需一级抗体浓度的蛋白LoBind管中，37°C，5天，轻轻搅动。
  2. 在抗体治疗期间，以3×5分钟的爆发施加-100kPa的真空，每天3次以帮助促进初级抗体浸润。
2. 用50 ml PBST洗涤3次，每次24小时
3. 按照上述步骤E2a和E2b进行二抗。
4. 用50ml N 3 PBS洗涤3次，每次24小时注意：对于使用相同样品的多轮免疫组织化学，重复方案步骤D1和D2以在成像后剥离前抗体，然后使用如方案步骤F1-F4所述的不同组的一抗和二抗重新探测。 br />
  
  图1.普通烟叶的清除，安装和成像。左图：1.完全膨胀的新鲜叶片。 tabacum 叶。 2.固定，水凝胶嵌入，被动清除叶盘。 3.清除细胞壁酶处理的叶盘用于免疫组织化学和成像。 4.共焦成像的安装程序的示例。比例尺= 1mm。右图：A.被动清除的细胞壁酶处理（PEA-CLARITY）Sv-40（核定位GFP-绿色）N的CLSM 3D投影。烟草RuBisCO原代和Cy5二次免疫染色（红色）。 3D投影在（B）中示出，x，y，z切片分别在（A，C，D）中示出。 E.CLSM被动清除（无细胞壁酶消化）N的3D投影。（红色）染色的细胞核和用calcofluor白（绿色）染色的细胞壁。使用Leica应用套件 - 荧光（LAS-AF）软件生成3D投影。参见，Palmer等人。（2015）了解更多详情
成像准备（图1.4）
注意：在该方案期间，样品被固定在PBS中，然而，如（Palmer等人，2015）所述的其他固定介质如Focus Clear（Chung等人，2013）和RIMS（Yang等人，2014 ）可用于光学匹配水凝胶以增强图像清晰度。如果使用其他固定介质，则样品需要在安装前孵育。
1. 使用一小块BluTack通过将腻子滚动成长圆柱形状并应用于玻璃显微镜载片，使得孔的侧面刚好高于样品厚度（〜2mm），从而产生孔。
2. 密封BluTack井的外边缘和显微镜载玻片与一薄层凡士林。
3. 用PBS（或固定介质）填满一半。
4. 将样品放入孔中，并用PBS（或封固剂）盖上
5. 将玻璃显微镜盖玻片盖在井上，确保没有气泡。
6. 样品现在可以成像。

数据分析

本文中显示的所有图像都是从Leica SP8（图1A-1E）拍摄的原始图像。未处理的3D重建在徕卡应用套件 - 荧光（LAS-AF）软件中进行。

食谱

水凝胶溶液（200ml）
注意：存储在4°C。
SDS清洗溶液（1L）
酶处理溶液[EM]（10ml）

注意：使新鲜，不要存储。只使用已通过大小分离凝胶质量控制程序的酶来评估纯度，例如Megazyme列出的那些。

致谢

我们要感谢Mark Talbot在CLSM测量期间提供有用的建议，David McCurdy提供Sv-40 N。 tabacum，用于提供RuBisCO抗体的Spencer Whitney，用于初始CLSM研究的Vivien Rolland和用于生长植物的Joe Enright。

参考文献

Chung，K.，Wallace，J.，Kim，SY，Kalyanasundaram，S.，Andalman，AS，Davidson，TJ，Mirzabekov，JJ，Zalocusky，KA，Mattis，J.，Denisin，AK，Pak，，H.，Ramakrishnan，C.，Grosenick，L.，Gradinaru，V.and Deisseroth，K.（2013）。完整生物系统的结构和分子探测。
497（7449）：332-337。

Hanson，MR和Kohler，RH（2001）。 GFP成像：用于研究植物中细胞分区的方法和应用。 52（356）：529-539。

Palmer，WM，Martin，AP，Flynn，JR，Reed，SL，White，RG，Furbank，RT and Grof，CP（2015）。 PEA-CLARITY：3D植物器官的3D分子成像。 Sci Rep 5：13492.

Whitney，SM and Andrews，TJ（2001）。基因的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）小亚基重定位到烟草的质体基因组指导组装成Rubisco的小亚基的合成。植物细胞（1）：193-205

（a，b，c，d，c，d，d，d，d，d，d，d） "ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25088144"target ="_ blank">透明完整组织通过全身清除的单细胞表型。 158（4）：945-958。