材料和试剂

Delta处理的10cm培养皿（Thermo Fisher Scientific，Nunclon ，目录号：153066）
15ml聚苯乙烯离心管（Corning，Falcon ，目录号：352095）
6孔悬浮板（SARSTEDT，目录号：83.3920.500）
96 V孔，2.0ml聚丙烯板（Greiner Bio One，MASTERBLOCK ，目录号：780285）
5ml圆底聚苯乙烯管（Corning，Falcon ，目录号：352054）
从BALB/c WT小鼠分离的骨髓来源的树突细胞（BMDC）（参见程序）
CT26坏死可诱导的细胞（DD_RIPK3）（Aaes等人，2016）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：41965062）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270106）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
L-谷氨酰胺（Lonza，目录号：BE17-605F）
Roswell公园纪念学院（RPMI）1640培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：52400025）
2-巯基乙醇（50mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31350010）
小鼠GM-CSF（VIB蛋白质服务设施，UGent-VIB炎症研究中心）
ACK裂解缓冲液（Lonza，目录号：10-548E）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14190094）
CellTracker 绿色CMFDA染料（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：C7025）
多西环素（Sigma-Aldrich，目录号：D9891）
B/B同源二聚体（Takara Bio，目录号：635059）
将纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32（小鼠BD Fc Block TM）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553142）
APC仓鼠抗小鼠CD11c（BD，Pharmingen ^TM，目录号：550261）
SYTOX蓝核酸染料（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：S11348）
BD FACSuite CS& T Research Beads Kit（BD，FACSuite ^TM，目录号：650621）
DMEM CT26培养基（参见配方）
RPMI BMDC /共培养培养基（参见配方）
FACS缓冲区（参见配方）
染色溶液（见配方）

设备

台式离心机
BD FACSVerse TM流式细胞仪（BD，型号：BD FACSVERSE）

软件

BD FACSuite ^TM软件（BD）
FlowJo软件版本10.0.8或更高版本（FlowJo）

程序

通过粉碎7周龄BALB/c WT小鼠的股骨和胫骨来分离骨髓细胞。将红细胞用ACK裂解缓冲液裂解，并使用RPMI培养基 - 每2ml每6孔400,000个细胞将细胞分化为树突状细胞8天。在第三天，加入2ml新鲜培养基，并在第6天用新鲜培养基替换培养基。

靶细胞死亡诱导，CT26 DD_RIPK3，细胞
1. 种子1×10 6个CT26 DD_RIPK3细胞在每10cm培养皿的10ml DMEM培养基中。
2. 等待5小时细胞附着。
3. 用无血清DMEM洗涤培养皿。
4. 向每个板中加入10ml无血清DMEM +1μMCellTracker ^TM绿色CMFDA。
5. 在37℃孵育30分钟。
6. 取出培养基，并用RPMI培养基洗涤平板
7. 向每个培养皿中加入10ml RPMI培养基，在37℃下孵育2小时
8. 通过加入1μg/ml多西环素+ 10nM B/B同型二聚体诱导细胞死亡
9. 在37℃下再孵育18小时。
与BMDCs共培养
1. 将BMDC和CT26靶细胞收集到单独的15ml Falcon管中
2. 计数细胞并将其重悬于RPMI培养基中
3. 将细胞接种在6孔悬浮板中
4. 种子400,000个BMDCs + 400,000个CT26细胞（比例1：1），总体积为4ml /孔。
5. 在37℃下孵育2小时。
6. 包括用于单染色和补偿控制单元的孔：
免疫染色
1. 将细胞转移到深的96孔板中。
2. 在4℃下以400xg 旋转5分钟。
3. 通过轻拂板弃去上清液，并将沉淀物重悬在200μlFACS缓冲液中
4. 在4℃下以400xg 旋转5分钟。
5. 将样品重悬于200μl染色溶液（或单染剂溶液）中，每8×10 5个细胞的最终抗体浓度（APC-CD11c）为0.1μg。
6. 在4℃下孵育30分钟，避光
7. 洗涤样品并在4℃下以400×g离心5分钟
8. 重悬在FACS缓冲液+1.25μMSYTOX？蓝色（或仅用于单染色样品的FACS缓冲液）中。
9. 转移到5ml Falcon 圆底管
10. 将样品保存在冰上（最多1小时），直到在流式细胞仪上采集
11. 在流式细胞仪上使用FACSuite ^TM获取每个样品最少50-100,000个事件。
FlowiO中的门控策略
使用允许仅分析单个细胞的门控策略来确定BMDC对CMFDA标记的死细胞材料的真实吸收，并且确定为CD11c + CMFDA + sup/+双重阳性细胞表示为所有CD11c ⁺细胞的百分比。有关FlowJo中使用的门控策略和补偿矩阵，请参见图1和表1

图1.在FlowJo中用于分析的门控策略。图1显示了在FlowJo中分析结果时使用的门控策略。使用前向和侧向散射区（FSC-A对SSC-A），碎片被排除在分析之外。在以下两个步骤中，通过围绕单个细胞绘制栅极，去除双峰细胞，其大致沿着FSC-A对比FSC-H的对角线聚集，随后是SSC-A对比SSC-H。活/死染色，在这种情况下SYTOX 蓝，用于消除死细胞。在最后一组中，通过绘制细胞跟踪器绿色CMFDA（靶细胞）对CD11c-APC（BMDC），可以分析活的，SYTOX 蓝阴性细胞的吞噬作用。 >
表1.在FlowJo中生成的用于分析吞噬BMDC的补偿矩阵

数据分析

软件

BD FACSuite ^TM软件（BD）
FlowJo软件版本10.0.8或更高版本（FlowJo）

实验应重复至少三次，每次包括每个样品的三次重复。 BMDC对活细胞的摄取与坏死细胞的摄取之间的统计学差异可以用Mann-Whitney非参数性测试来分析。
吞噬BMDC（参见图1的图例中的门控策略）计算为双阳性CMFDA + CD11c +细胞（已经吞噬靶细胞的BMDC）的百分比，在所有CD11c ⁺细胞（总BMDC群体）中

笔记

为了验证靶细胞中细胞死亡诱导的效率，建议在流式细胞仪上与吞噬作用分析并行进行细胞死亡分析。细胞死亡分析应包括与Annexin V荧光探针组合的核酸染色（Aaes等人，2016）。用多西环素诱导18小时导致> 85％细胞死亡。

食谱

DMEM CT26培养基
注意：储存在4°C;使用前加热至37°C。
DMEM
10％FBS
1.3％丙酮酸钠 1.4mM L-谷氨酰胺
RPMI BMDC /共培养培养基
注意：储存在4°C;使用前加热至37°C。
RPMI
5％FBS
1.3％丙酮酸钠 1.4mM L-谷氨酰胺 50μM2-Me
20ng/ml mGM-CSF
FACS缓冲区
注意：存储在4°C。
DPBS
0.5％FBS
染色溶液
注意：请在使用前准备好冰箱。
FACS缓冲区
Fc Block ^TM稀释1/250
APC仓鼠抗小鼠CD11c稀释1/350

致谢

Peter Vandenabeele的研究小组是根特癌症研究所（CRIG）的一部分。资助由国际大学吸引波兰学院（IAP 7/32），研究基金会佛兰德斯大学（FWO），Met耶路撒冷补助金，根特大学补助金和比利时癌症基金会支持。
作者声明没有利益冲突。

参考文献

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Brouckaert，G.，Kalai，M.，Krysko，DV，Saelens，X.，Vercammen，D.，Ndlovu，MN，Haegeman，G.，D'Herde，K.and Vandenabeele，P。巨噬细胞对坏死细胞的吞噬作用是磷脂酰丝氨酸依赖性的，不会诱导炎症细胞因子产生。 Mol Biol Cell 15（3）：1089-1100
Krysko，DV，Denecker，G.，Festjens，N.，Gabriels，S.，Parthoens，E.，D'Herde，K.and Vandenabeele，P。（2006）。巨噬细胞使用不同的内化机制清除凋亡和坏死细胞。细胞死亡差异 13（12）：2011-2022。

Obeid，M.，Tesniere，A.，Ghiringhelli，F.，Fimia，GM，Apetoh，L.，Perfettini，JL，Castedo，M.，Mignot，G.，Panaretakis，T.，Casares，N.，Metivier， D.，Larochette，N.，van Endert，P.，Ciccosanti，F.，Piacentini，M.，Zitvogel，L.和Kroemer，G.（2007）。钙网蛋白暴露决定了癌细胞死亡的免疫原性。
1）：54-61