材料和试剂

1.5 ml Eppendorf管
Hamilton玻璃注射器（Hamilton，目录号：Gastight 1700）
金属针
剃刀刀片（VWR，目录号：55411）
TLC硅胶60板（图S1 < a）（EMD Millipore，目录号：105626）
果蝇（Genesee Scientific，Flystuff，目录号：32-109）
Whatman色谱层析纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA3030861）
黑腹果蝇
D - [14 C（U）] - 葡萄糖（PerkinElmer，目录号：NEC042V250UC）
酵母提取物
糖
液氮和氮气
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：366927）
甲醇（EMD Millipore，目录号：MX0475-1）
硫酸铜（EMD Millipore，目录号：102790）
O-磷酸（85％）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A242-212）
脂质标准：

三油酸甘油酯（Sigma-Aldrich，目录号：T7140）
磷脂酰胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：P3556）
磷脂酰肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：P6636）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
月桂酸（Sigma-Aldrich，目录号：L556）
肉豆蔻酸（Sigma-Aldrich，目录号：M3128）
棕榈酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0500）

己烷（Sigma-Aldrich，目录号：32293）
二乙醚（Sigma-Aldrich，目录号：309966）
乙酸（AMRESCO，目录号：0714）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
闪烁液（PerkinElmer，目录号：Ultima Gold ^TM/6013329）
食谱（参见食谱）
溶剂混合物（参见配方）
硫酸铜/磷酸溶液（参见配方）
0.9％NaCl溶液（见配方）

设备

TLC室（Clarkson Laboratory and Supply，型号：Latch-Lid ChromatoTank 80-30）
Kontes微量离心机马达和杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z359971-1EA）
离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5810R）
台式真空炉（VWR，型号：97027）
闪烁计数器（Beckman Coulter，型号：LS6500）
闪烁瓶（PerkinElmer，目录号：6000292）
Nalgene PPCO洗瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2405-0500）

程序

该测定描述了维持在两种不同饮食中的成年交配的果蝇雌性的脂肪周转。饮食是HY（含有5％酵母提取物和5％糖的高酵母）和LY（低酵母，含有0.5％酵母提取物和5％糖，参见Katewa等人，2016）。在第十天，将约300只苍蝇（12批，每只25只苍蝇）转移到具有2μCi14 C标记的葡萄糖的新鲜食品小瓶中。通过在顶部加入30μl的5％糖/葡萄糖溶液制备小瓶，并使其沉降4小时。为了制备糖/葡萄糖溶液，将100μl的D - [葡萄糖] 14 C（U）] - 葡萄糖加入到900μl的5％糖溶液中。
注意：当在食物顶部添加30μl糖/葡萄糖溶液时，最好使用更接近常规实验室飞行食物中糖浓度的糖浓度。例如，如果您的实验室在飞行食物中使用10％的糖，则使用10％的糖溶液制作糖/葡萄糖溶液。
将苍蝇保持在标记的食物上24小时，之后将一半的苍蝇在液氮中速冻。这是0小时的样本。将另一半转移到新鲜的非放射性食品小瓶中，并在此食物上保持接下来的60小时，然后立即冷冻。这是60小时的样本。
对于脂质提取，称重约20mg苍蝇/复制。重量对于脂质的归一化和提取是重要的。果蝇的数量将根据实验中使用的饮食而不同。例如，要从HY组得到约20毫克的总重量，我需要约15-18雌性苍蝇，而对于LY组，我需要约22-25苍蝇。使用Kontes微量离心机和研杵在1.5ml Eppendorf管中将苍蝇在约100μl的0.9％NaCl中匀浆化。将匀浆转移到2ml玻璃小瓶中。使用额外的100μl的0.9％NaCl溶液冲洗Eppendorf管，并转移到玻璃小瓶。加入800微升氯仿：甲醇（2：1，v/v）与玻璃小瓶与匀浆，涡旋15秒，并让其在室温下静置20分钟。再次涡旋15秒并在1,640×g离心10分钟以分离两相。通过使用玻璃Hamilton注射器，小心地除去含有脂质级分的下相（Folch等人，1957）。
将脂质级分转移到玻璃小瓶中并在连续氮气流下干燥（总是在指定用于放射性工作的化学通风橱中）。玻璃吸管或金属针可以在气体供应的端部处附接并悬挂在玻璃小瓶中（离溶剂表面大约一英寸）。一旦完全干燥，加入100微升氯仿的管。
注意：有两种方法将脂质分成不同的级分。一种方法是使用固相萃取（SPE）管（详见Katewa等人，2012）;另一种方法是使用薄层色谱（TLC）板（Chatterjee et al。，2014; Katewa et al。，2016）。这里我描述TLC协议，因为它是有成本效益的，更简单，也提供脂质的视觉分离。
使用玻璃Hamilton注射器在TLC板上点样重悬的脂质。加载25μg甘油三油酸酯以鉴定甘油三酯（TG）迁移带。将板在化学罩中风干约20分钟。在预处理的TLC室中，在溶剂混合物（参见Recipe section，Kishimoto等人，2001）中显影板。腔室的前提条件包括几个额外的步骤。通过将室中的溶剂混合物（己烷/乙醚/乙酸[70/30/1，v/v]）的所有组分加入，覆盖室并剧烈混合来制备室。另外，为了使溶剂在TLC上正确迁移，TLC室的内侧衬有两层重叠的Whatman色谱纸，使得它排列室的背面和侧壁图1）。接下来，盖上腔室，让它平衡30分钟，然后将第一个TLC放入腔室注意：斑点应至少比溶剂水平高出一厘米。

图1.具有盖的TLC室。 TLC室内衬有两个重叠的Whatman色谱纸，用于室的饱和。内部Teflon ^?涂层机架允许同时运行多个TLC板
将干燥的TLC板装载在室中，并使其运行10-15分钟（取决于液体前沿的迁移速率）。取出板，在化学罩中风干。
为了目测TG斑点，用硫酸铜/磷酸溶液喷雾TLC板（参见食谱部分），并使其风干30分钟。将板在烘箱中在125℃加热30-45分钟（直到TG带可见）。取出板，让它冷却。图2显示了TLC分离不同脂质类别的效率

图2.不同脂质与成年雌性果蝇黑腹果蝇的TLC分离从15-20只成年雌蝇中提取总脂质，干燥并重悬于100μl氯仿中并加载在TLC板上。进一步显影板以显现不同脂质的迁移。泳道布置如下：泳道1，磷脂（PL，10μg磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇的1：1混合物）。泳道2，甘油三酯（TG，25μg甘油三油酸酯）。泳道3，胆固醇（CHL，10μg）。泳道4，月桂酸（LA，10μg）。泳道5，肉豆蔻酸（MA，10μg）。泳道6，棕榈酸（PA，10μg）。泳道7，ALL（所有标准以相等比例混合）和泳道8,100μl飞样品
来自板的TG带用剃刀刀片刮下并转移到闪烁瓶中。加入约0.5ml己烷以从二氧化硅中提取TG。加入3ml闪烁液，混合并计数^{14℃放射性。 0小时样品中的放射性计数表示葡萄糖掺入甘油三酯的量，并且在60小时样品中的放射性计数表示仍保留的标记TG的量。 0h和60h样品之间的差异表明标记的甘油三酯的分解}

数据分析

存在于0小时样品中的14 C的量表示TG的新合成，并表示为CPM/mg飞重。使用包含5-6个独立的15-25个蝇的样本的一个实验来获得平均值±SEM。应进行额外的实验重复以确认观察结果。基于研究的设计，可以使用Student's - 检验或ANOVA获得显着性。在这里，已经使用了两种不同的饮食，并且结果（图3）表明，与苍蝇相比，低酵母（LY）饮食中的雌蝇显示增加的新合成和更快的TG分解喂食高酵母（HY）饮食注意：最好使用独立瓶子在一个实验中获得飞行副本。

图3.在高酵母（HY）和低酵母（LY）饮食饲喂的成年雌性果蝇中的脂肪周转。在0小时样品中掺入的^{14的量表示 TG的新合成。 60小时样品指示击穿。 Student's t检验用于测量统计学显着性，误差条表示5种独立制剂的SEM（*表示P <0.05，**表示P <0.001）}

食谱

果蝇食谱
详细的飞行培养基配方可以在Katewa等人的补充实验程序部分中找到。（2016）。
溶剂混合物
己烷/乙醚/乙酸（70/30/1，v/v）。在TLC室中加入105ml己烷，45ml乙醚和1.5ml乙酸，并剧烈搅拌。
硫酸铜/磷酸溶液
8％硫酸铜在10％磷酸水溶液中
0.9％NaCl溶液
9克NaCl在1升双蒸水中洗涤

致谢

SDK承认美国老龄化研究联合会和Larry L. Hillblom基金会的资助。

参考文献

Chatterjee，D.，Katewa，SD，Qi，Y.，Jackson，SA，Kapahi，P.，and Jasper，H。（2014）。通过dILP6诱导的胰岛素信号在果蝇细胞中控制对空腹的代谢适应。 Proc Natl Acad Sci USA 111（50）：17959-17964。

Folch，J.，Lees，M.和Sloane Stanley，GH（1957）。一种用于从动物组织中分离和纯化总脂质的简单方法。 J Biol Chem 226（1）：497-509。

Katewa SD，Akagi K，Bose N，Rakshit K，Camarella T，Zheng X，Hall D，Davies S，Nelson C，Brem RB，Ramanathan A，Sehgal A，Giebultowicz JM and Kapahi P（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26626459"target ="_ blank">外周昼夜节律调节膳食限制依赖于寿命和脂肪代谢的变化，果蝇。细胞代谢。 23（1）：143-154

Katewa，SD，Demontis，F.，Kolipinski，M.，Hubbard，A.，Gill，MS，Perrimon，N.，Melov，S。和Kapahi，P。（2012）。肌内脂肪酸代谢在介导对果蝇中饮食限制的反应中起关键作用/em> melanogaster。 Cell Metab 16（1）：97-103。

Kishimoto，K.，Urade，R.，Ogawa，T.and Moriyama，T。（2001）。通过薄层色谱和激光荧光扫描对中性脂质的非破坏性定量：用于"脂质体"分析的合适方法。生物化学与生物物理学通讯281（3）：657-662。