材料和试剂

聚乙烯亚胺（PEI） - 纤维素TLC板（Sigma-Aldrich，目录号：Z122882）
1.5 ml无菌微量离心管，带盖
铝箔
天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor）
32 P标记的正磷酸盐（PerkinElmer，目录号：NEX053H001MC）
注意：使用放射性物质需要机构授权。
丝氨酸氧肟酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：S4503）
MilliQ质量水（dH 2 O）
甲酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A118P100）
100％乙醇在室温下洗涤
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：60218）
3-吗啉代丙烷-1-磺酸（MOPS）（AMRESCO，目录号：0670）
蔗糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP220-1）
硫酸镁七水合物（AMRESCO，目录号：0662）
葡萄糖/葡萄糖（VWR，目录号：BDH9230）
Bacto TM酵母提取物（BD，目录号：212750）
Bacto ^{TM胨蛋白胨（BD，目录号：211677）}
Bacto ^TM胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
酪蛋白氨基酸（BD，目录号：228830）
L-组氨酸单盐酸盐一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：H8125）
L-色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254）
L-酪氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T3754）
L-脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P0380）
用于分散菌丝体的弹簧（不锈钢）（例如，Grainger，目录号：1NCH7）（专用于分散天蓝色素）
干冰
单磷酸鸟苷（Sigma-Aldrich，目录号：G8377）（可选）
鸟苷三磷酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）（可选）
修改MOPS基本媒体（用于生长天蓝色，请参阅配方）
1.5M KH 2 PO 4（pH 3.4）（参见配方）
13 M甲酸（见配方）
100 mM丝氨酸氧肟酸盐（参见配方）
ISP1培养基（用于生长天蓝色，参见Recipes）

设备

50ml玻璃锥形瓶
带有盖的TLC室（Sigma-Aldrich，目录号：Z126195）
Phosphorimager（GE Healthcare）
带有储存盒（GE Healthcare）的荧光屏
速度高达16,000 x g的冷冻微量离心机和适用于1.5 ml离心管的转子
带温度控制的振荡培养箱

软件

ImageQuant软件

程序

建立文化（图1）
1. 在摇动培养箱（180rpm）中，在28℃下，在5ml的ISP1培养基中在无菌的50ml玻璃烧瓶中生长天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）。
  注意：
  1. 孵育温度是特异于天蓝色链霉菌的，并且可能需要针对其他细菌种类进行调整。
  2. 在生长介质中加入弹簧以分散菌丝体，减少结块。
2. 添加150微升此培养物至600微升修改MOPS基本培养基无菌1.5毫升管
3. 通过涡旋和移液分散菌丝，并转移200微升到两个无菌1.5毫升管。
4. 从这一步向前，将样品放在辐射屏幕后面，并遵循放射性材料处理和处置的适当做法。只有各自机构的辐射安全办公室授权的认证人员才能处理放射性物质
5. 向200μl培养物样品中加入1.7μl32P标记的正磷酸盐（总共30μCi），并在摇床培养箱中培养6小时（OD 600 = 0.4） -0.6）。
6. 向其中一个管中加入75μl100mM丝氨酸异羟肟酸盐，并向另一个管中加入75μl无菌dH 2 O。
7. 充分混合并在28℃下在摇床培养箱中孵育15分钟
8. 在4℃下以10,000×g离心样品5分钟，弃去上清液，向沉淀中加入25μl13M甲酸，并通过涡旋重悬沉淀。
  注意：使用冰冷的甲酸会迅速停止代谢活动。如果可能，通过在加入甲酸之前从含有颗粒的管的重量减去空管的重量并且如果需要调整用于重悬颗粒的甲酸的量来估计颗粒的重量。立即丢弃上清液，否则沉淀会松动。
9. 对于细胞裂解，在干冰上孵育1分钟，并在乙醇浴中在室温下孵育1分钟。
10. 重复步骤9四次。
11. 在冰上孵育样品30分钟。
12. 涡旋样品，并在4℃下以12,000×g离心10-15分钟。
13. 将上清液储存在-20℃的1.5ml试管中
  
  图1.设置文化
设置薄层色谱（图2）
1. 将1.5M KH 2 PO 4（pH 3.4）缓冲液倒入TLC室中，使得其在底部形成薄层（?0.5cm）（在此使用50ml）），并关闭盖子，以使缓冲液蒸汽使室内饱和（至少30分钟）注意：在插入PEI-纤维素板之前，需要足够的时间使KH sub 2 PO 4缓冲液蒸汽饱和TLC室。可以通过首先将滤纸切割成小于PEI-纤维素板的尺寸并将它们浸入1.5M KH 2 PO 4缓冲液中来促进该过程。将浸泡的纸张靠着TLC室的侧面，让蒸气均匀地扩散到整个室中。饱和腔室将防止流动相随着其在板上迁移而蒸发。
2. 使用铅笔，从PEI-纤维素板的底部画大约1cm的线，并在其上形成大约2cm的细小的点以标记用于样品加载的点。
  注意：
3. 解冻样品（上面的项目13），将1μl样品点在基线上的细小点上，并风干2-4分钟。记下在每个点上点样的样品。
  注意：对于较低浓度的样品和获得核苷酸物质的更密集的斑点，在间歇性空气干燥的情况下向相同斑点添加1μl的增量。允许每个等分试样在应用第二等分试样之前干燥将防止样品扩散，如果一次添加更大的体积则会发生。
4. 将PEI-纤维素板放置在室中，其应该放置在水平表面上，使得TLC板的基底均匀地浸没在缓冲液中。
5. 关闭盖子，让流动相缓冲液迁移，直到它靠近（但不是在板的顶部）（约3小时）的顶部。
6. 取出板，用铅笔标记缓冲液前部的顶部，以确定流动相迁移的距离，然后将板空气干燥15分钟或更长时间。
7. 将板放置在干净的盒中，将放射性表面暴露于荧光屏24小时或更长时间，这取决于32 P信号的强度。
8. 在phosphorimager上扫描曝光的荧光屏，保存图像
  
  图2.设置TLC

数据分析

计算不同磷酸化核苷物质的迁移（保留因子，Rf）相对于Rf =（核苷酸物质行进的距离）/（流动相行进的距离）的相对距离，两个距离均相对于TLC上绘制的基线板（来源;图3）。在相同条件下获得的Rf值可以与先前公布的化合物鉴定结果进行比较（Calderón-Flores等人，2005; Mechold等人，2013）。更高度磷酸化的物质更强地吸附到TLC板上的PEI上，并将迁移更短的距离。使用独立培养物重复实验至少两次以验证数据注意：

核苷酸迁移的实际距离取决于流动相的迁移距离，为了比较目的，需要计算Rf值。
为了验证样品的身份，可以将未标记的核苷酸点在板上，并通过暴露于UV光来鉴定它们的迁移;该板在紫外光下是荧光的，并且核苷酸将吸收光，导致阴影的出现。
示例数据分析和Rf的计算：
流动相行进距离= 12.2cm;由GTP迁移的距离= 6.5cm;距离由ppGpp = 2.9cm迁移;由pppGpp迁移的距离= 1.7厘米。
对于GTP，Rf = 6.5cm/12.2cm = 0.53
对于ppGpp，Rf = 2.9cm/12.2cm = 0.23
对于pppGpp，Rf = 1.7cm/12.2cm = 0.13

图3.从S的指数期培养物中提取的核苷酸（磷酸化鸟苷）的薄层色谱。（第一泳道）和30mM丝氨酸氧肟酸盐（第二泳道）处理15分钟后的天蓝色处理。该图从Sivapragasam和Grove的图10A修改（2016）。

使用ImageQuant软件定量对应于不同核苷酸物质的斑点的密度。为了比较不同样品之间的ppGpp和pppGpp的相对水平，在校正每个核苷酸的磷酸酯数目的斑点强度之后，核苷酸物质的斑点强度可以除以ppGpp和pppGpp的组合强度。
示例数据分析和ppGpp和pppGpp的相对水平的计算：

校正磷酸盐数量后的ppGpp的点密度：从ImageQuant获得的ppGpp的密度（体积/面积）除以4（磷酸盐数）= 131.52/4 = 32.88
校正磷酸盐数量后的pppGpp的点密度：从ImageQuant获得的pppGpp的密度（体积/面积）/5（磷酸盐数）= 23.32/5 = 4.66
ppGpp和pppGpp的总校正点密度：32.88 + 4.66
ppGpp的相对水平：ppGpp的校正点密度/ppGpp和pppGpp的总校正点密度= 32.88 /（32.88 + 4.66）×100％= 87.6％
pppGpp的相对水平：pppGpp的校正点密度/ppGpp和pppGpp的总校正点密度= 4.66 /（32.88 + 4.66）×100％= 12.4％

笔记

因为保持 S是有挑战性的。 coelicolor 菌丝体在生长期间分散，从每个培养条件收集几个样品，建议增加收集每个条件相当数量的细胞的机会。
应当注意，丝氨酸氧肟酸盐不会在所有细菌种类中诱导严格反应

食谱

修改的MOPS基本媒体（用于生长天蓝色）
100 mM MOPS
10％蔗糖 1％葡萄糖 2mM MgSO 4 0.5％酵母提取物
0.2％蛋白胨 0.15％酪蛋白氨基酸 30mM K 2 HPO 4（如在完全培养基中）
将所有上述成分加入800ml去离子水中。高压灭菌缓冲液
将50mg氨基酸组氨酸，脯氨酸，酪氨酸和色氨酸（每种氨基酸）加入到100ml去离子水中。混合并轻微加热，直到所有粉末溶解。过滤溶液并加入到上面制备的缓冲液中。使用高压灭菌的去离子水将体积补至1升。
1.5M KH 2 PO 4（pH 3.4）在60ml的dH 2 O中的20.4g的KH 2 PO 4溶液。
使用HCl<
将pH调节至3.4 用dH 2 O 2/
将体积补至100ml
13 M甲酸
将2.787ml甲酸储备溶液（88％）缓慢加入到1.25ml dH 2 O 2中
使用dH 2 O
100mM丝氨酸氧肟酸酯将12.11mg粉末加入1ml dH 2 O中并涡旋
过滤灭菌并储存在-20℃下
ISP1培养基（用于生长天蓝色）
将5g胰蛋白胨和3g酵母提取物加入1L dH 2 O 2中高压灭菌器

致谢

这项工作是由国家科学基金会（MCB-1515349到A.G.）支持。我们要感谢Nabanita Bhattacharyya协助摄影和所有Grove实验室成员的建议和有益的讨论。该协议衍生自最初在Molecular Microbiology中发表的（Sivapragasam和Grove，2016）。

参考文献

Calderon-Flores，A.，Du Pont，G.，Huerta-Saquero，A.，Merchant-Larios，H.，Servin-Gonzalez，L.and Duran，S。（2005）。严格的反应是氨基酸和硝酸盐利用，点头因子调节，结瘤和氮需要的固定在根瘤菌（Rhizobium etli）中。 187（15）：5075-5083。
Mechold，U.，Potrykus，K.，Murphy，H.，Murakami，KS和Cashel，M.（2013）。通过ppGpp与pppGpp在大肠杆菌中的差异调节核酸研究41（12）：6175-6189。
Sivapragasam，S.和Grove，A.（2016）。 < em>天蓝链霉菌 XdhR是（p）ppGpp的直接靶标，其控制编码黄嘌呤脱氢酶的基因的表达以促进嘌呤补救。 100（4）：701-718。
Strauch，E.，Takano，E.，Baylis，HA和Bibb，MJ（1991）。 A3（2）中的严格反应。 5（2）：289-298。