第一部分糖酵解分析

材料和试剂

60mm组织培养皿（TPP，目录号：93060）
XF测定24孔盒和细胞培养微板V7（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience，目录号：100850-001）
8-15周龄C57BL/6小鼠（Janvier实验室）
胶原I型，大鼠尾（EMD Millipore，目录号：08-115）
M199培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：41150020）
胰蛋白酶（2.5％），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15090046）
胎牛血清（FBS）
适于细胞培养的DMEM（不含葡萄糖，L-谷氨酰胺，酚红，丙酮酸钠和碳酸氢钠）粉末（Sigma-Aldrich，目录号：D5030-10X1L）
D - （+） - 葡萄糖溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G8769）
L-谷氨酰胺，200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030081）
XF校准溶液（Agilent Technologies，Seahorse Bioscience，目录号：100840-000）
PierceBCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：23225）
氯化钠（NaCl）（AppliChem，目录号：A3597）
酚红钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：P5530）
Tris，pH7.5（Applichem，目录号：A1379）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
糖酵解介质（参见配方）
9x葡萄糖溶液（见配方）
裂解缓冲液（参见配方）

设备

CO 2 sub-free培养箱设置为37℃（Memmert或其他供应商）
5％CO 2孵育器设置为37℃（Salvis Lab或其他供应商）
离心机
XF 24胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）
细胞培养罩（Vitaris或其他供应商）
pH计（Mettler Toledo或其他供应商）
细胞计数器（Thermo Fisher Scientific或其他供应商）

软件

海马软件（XFReader 24版本1.6供应XF 24细胞外通量分析仪）

程序

根据Dentin等分离来自8-15周龄C57BL6/J小鼠的肝细胞。（2004）。在PBS中稀释50μg/ml的股票胶原蛋白I（不要重复使用溶液，因为胶原蛋白I将在中性pH下沉淀）。用胶原蛋白I（在室温[RT]下10-20分钟）涂覆60mm培养皿就足够了。然后每板平板200万肝细胞，并在5％CO 2培养箱中在37℃孵育。 2小时后，更换新鲜的M199培养基
在开始糖酵解实验之前至少6小时将该盒子在37℃的CO 2无培养箱中用每孔1ml XF校准物浸泡。
在肝细胞分离后24小时，用胶原I（50μg/ml，室温下10分钟）包被Seahorse XF 24板的24孔。然后通过与胰蛋白酶孵育1-2分钟分离细胞。停止胰蛋白酶用10％FBS补充培养基。离心并用自动细胞计数器计数肝细胞。在100μl糖酵解介质中每孔铺板40,000个细胞。保持4个井，只有100微升的媒体（没有细胞）的XF24细胞外通量分析仪的背景校正注意：播种后，肝细胞活力应大于80％。
在制造商指示的CO 2无培养箱中在37℃下孵育细胞30分钟（CO 2可以通过其水合成为碳酸来参与培养基的酸化和碳酸氢盐）。然后在每个孔中加入500μl的37℃糖酵解培养基（总体积为600μl）。
在这30分钟内，加载盒的端口A（图1），其中含有75μl的9x葡萄糖溶液的探针。根据制造商在Seahorse软件上准备协议。选择3分钟混合，2分钟等待和3分钟测量海马测定的参数

图1.注入端口布局
启动协议并将校准液加载到XF24海马装置（按照软件指示）。在校准结束时，将校准板用电池板替换。
在第一次测量后，在肝细胞呼吸的功能中，修改程序：如果OCR（氧消耗速率）高于200pMoles氧/分钟，将程序改变为4分钟混合，2分钟等待和2分钟测量（根据制造商说明）。
注意：对于肝细胞呼吸，OCR不应低于100 pMoles oxyge/min。
建议在基础下进行2或3次测量，在葡萄糖注射后进行10次测量
在运行结束时，在冰上裂解细胞在40μl裂解缓冲液中30分钟。使用BCA蛋白测定法定量蛋白质水平。

数据分析

使用Seahorse软件根据制造商通过蛋白质含量将结果标准化，并且可以表示为图2
实验必须至少进行2次，重复次数为8次。

图2.使用海马分析器（2次独立实验，每次重复8次）在注射葡萄糖之前和之后的C57B16/J肝细胞的ECAR的葡萄糖注射的代表性ECAR图。

笔记

该方案可以适应具体需要（使用遗传修饰的肝细胞，其他细胞类型）。

食谱

糖酵解介质
无葡萄糖，L-谷氨酰胺，酚红，丙酮酸钠和碳酸氢钠的DMEM，粉末，适用于细胞培养
143 mM NaCl 3 mg/L酚红
2mM谷氨酰胺在37℃下将pH调节至7.35
9x葡萄糖溶液（225mM） 4.55ml糖酵解介质
450μl2.5M葡萄糖
在37℃下将pH调节至7.35
裂解缓冲液
150mM NaCl 50mM Tris（pH7.5） 5 mM EDTA
1％Triton X-100 蛋白酶抑制剂（1x）

第II部分。脂肪生成分析

材料和试剂

6孔板（Corning，Costar ，目录号：3335）
刮刀（Corning，目录号：3010）
玻璃巴斯德移液器
塑料袋
8-15周龄C57BL/6小鼠（Janvier实验室）
氮气（Carbagaz或其他供应商）
胶原I型，大鼠尾（EMD Millipore，目录号：08-115）
M199培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：41150020）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D1756）
胰岛素（Actrapid HM，Novo Nordisk）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
D - （+） - 葡萄糖溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G8769）
乙酸，钠盐，[1- 14 C]，1μCi/μl（PerkinElmer，目录号：NEC084H001MC）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：34854）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
预涂覆的TLC片，0.2mm硅胶（MACHEREY-NAGEL，目录号：805013）
碘（Sigma-Aldrich，目录号：207772）
二乙醚（Sigma-Aldrich，目录号：309966）
石油醚（Sigma-Aldrich，目录号：320447）
乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
氯仿/甲醇（2：1）（参见配方）
TLC迁移溶剂（参见配方）

设备

5％CO 2孵育器设置为37℃（Salvis Lab或其他供应商）
细胞培养罩（Vitaris或其他供应商）
超声水浴（Bioruptor）
Vortex（科学工业或其他供应商）
用于20×20cm平板（带盖）（CAMAG，目录号：022.5250）的TLC显影室
化学发动机罩
Cyclone Plus存储荧光粉扫描仪（PerkinElmer，目录号：C431200）
MS多重敏感荧光屏（PerkinElmer，目录号：7001723）
离心机

软件

OptiQuant软件（配备Cyclone Plus存储荧光扫描仪）

程序

根据Dentin等分离来自8-15周龄C57BL6/J小鼠的肝细胞。（2004）。如前所述，用胶原I（室温下10分钟）包被6孔板的孔，每孔涂布1百万个细胞。 2小时后，用新鲜的M199更换培养基
第二天，用非刺激（G5）和刺激（G25i）条件处理细胞24小时：
一个。低葡萄糖（G5）：M199培养基（葡萄糖5mM）加上地塞米松10μM-7 M.
b。高葡萄糖胰岛素（G25i）：补充有25mM葡萄糖，加胰岛素100nM和地塞米松10μM7的M199培养基（葡萄糖5mM）。
在培养基中加入乙酸盐14（0.5μCi/孔[0.5μl]）。 C ¹⁴将被并入新的合成脂质中。
2小时后，用PBS洗涤细胞2次，并将每孔的细胞倒入400μlPBS中。然后将400μl分成100μl和300μl，分别用于蛋白质定量和脂质提取，如下所述
用于蛋白质定量。在-20°C冷冻以改善蛋白质的裂解。（任选：在超声水浴中超声15秒）。使用BCA蛋白测定法定量
从300μl左边，在化学罩下进行脂质提取如下。添加100微升的M199介质与酚红，以方便识别后阶段的两个阶段。然后加入1.6ml氯仿/甲醇（2:1）并涡旋5-10分钟。在RT下以15,000×g（RCF）离心5分钟，并用玻璃巴斯德吸管收集有机相（下相）。酚红有助于区分两相。然后在氮气吹扫下蒸发（约20至40分钟），并用150μl氯仿/甲醇（2:1）重悬。
在TLC显影室中加入1cm的TLC迁移溶剂，在TLC显影室中装入TLC板之前20分钟
在距离TLC板底部2cm处用铅笔标记线。样品将在每条1.5-2厘米的线上加载。加载40微升作为点在TLC板上。为避免太大的点，在加载的同时，吹氮气即可干燥
将TLC板装载在TLC显影室中。使TLC板迁移至顶部1cm（约45分钟）
（任选）TLC迁移后，可以显现脂质。在化学罩下，在罩下干燥TLC板并在干净的TLC室中用碘对脂质进行染色。在TLC室的底部加入一些碘石并放置TLC板。等待，直到出现棕色（10到20分钟）。您可以在引擎盖下拍摄照片，或者您可以将板放在封闭的塑料袋中进行扫描。在一个封闭的瓶子中恢复碘结石（它们可以无限期使用）。注意，着色在室外消失。除去罩下的着色（约10分钟）。
在薄膜盒中将TLC暴露于MS多重敏感荧光屏至少5天。然后使用Cyclone Plus存储荧光扫描仪扫描屏幕（图3）。

图3.在TLC板上样品迁移后的代表性扫描。在TLC迁移后C 14标记的脂质的可视化。来自肝细胞的样品用G5或G25i处理24小时，其中在板的底部上的负载。突出显示TG。

数据分析

使用扫描仪附带的OptiQuant软件，通过量化TG光斑强度来确定TG中结合的C ¹⁴的水平。
结果通过蛋白质含量归一化，并表示为相对于作为100％掺入的对照条件（G25i）的相对值。
实验必须进行三次，一式三份，最少。

笔记

每个条件必须一式三份执行。 G5和G25i是在野生型肝细胞中脂肪生成分别低和高的条件。 G25i中的肝细胞预期具有3倍以上的脂肪生成（Denechaud等人，2016）。
脂质提取，TLC迁移，TLC着色（碘）必须在化学罩下进行
任何phosphorimager扫描仪都可用于扫描TLC板
该方案可以适应具体需要（特定培养条件，使用转基因肝细胞，其他细胞类型）。

食谱

氯仿/甲醇（2:1）
2体积的氯仿/1体积的甲醇
TLC迁移溶剂
127ml石油醚
22毫升乙醚 0.5ml乙酸

致谢

我们感谢Isalel Lopez-Mejia博士有益的讨论和她在XF24细胞外通量分析仪的专业知识。这项工作得到瑞士血液癌症研究所，瑞士国家科学基金会和法国基金会的资助。我们感谢K. Schooonjans博士（EPFL，洛桑，瑞士）的他以前的工作（Oosterveer等人，2012），我们适应和修改糖酵解方案。

参考文献

Dentin，R.，Pegorier，JP，Benhamed，F.，Foufelle，F.，Ferre，P.，Fauveau，V.，Magnuson，MA，Girard，J.and Postic， ChREBP和SREBP-1c对糖酵解的协同作用需要肝葡萄糖激酶和脂质基因表达。 J Biol Chem 279（19）：20314-20326。
Denichaud，PD，Lopez-Mejia，IC，Giralt，A.，Lai，Q.，Blanchet，E.，Delacuisine，B.，Nicolay，BN，Dyson，NJ，Bonner，C.，Pattou，F.，Annicotte， JS和Fajas，L.（2016）。 E2F1介导持续的脂肪生成和有助于肝脂肪变性。 J Clin Invest 126（1）：137-150。
Oosterveer，MH，Mataki，C.，Yamamoto，H.，Harach，T.，Moullan，N.，van Dijk，TH，Ayuso，E.，Bosch，F.，Postic，C.，Groen，AK，Auwerx， J.和Schoonjans，K.（2012）。 LRH -1依赖性葡萄糖检测决定肝中的中间代谢。 122（8）：2817-2826。