材料和试剂

100mm皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：263991）
纸毛巾
外科刀片（FEATHER安全剃刀，目录号：25）
铝箔
rag1 突变成年雄性斑马鱼（Wienholds et al 。，2002）
L-15培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L5520-500ML）
25x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
乙基对氨基苯甲酸酯（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-03832）
庆大霉素（10mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15710064）
乙醇
10％对氨基苯甲酸乙酯储备溶液（见配方）
0.01％对氨基苯甲酸乙酯工作溶液（参见配方）
0.4x含有10μg/ml庆大霉素的PBS（见Recipes）

设备

立体显微镜（OLYMPUS，型号：SZ61）
钳（样式5）（Dumont，目录号：0108-5-PO）

程序

皮下移植
1. 在移植前1天，保持所有成年男性接受者的rag1 突变斑马鱼无食物。
2. 如（Sakai，2006）所述，从供体鱼中取出正常睾丸或自发性睾丸增生，并在L-15培养基中切成包含睾丸上皮的约2-3mm正方形。
3. 将纸巾放在100毫米的盘子里，倒入少量的0.4×PBS进入盘子
4. 用0.01％的对氨基苯甲酸乙酯麻醉受体斑马鱼。
5. 将麻醉的受体鱼放入100 mm培养皿中
6. 用湿纸巾覆盖受体鱼的头部和尾部（图1A，视频1）。
7. 去除移植部位。
8. 用剃刀刀片切开长约5 mm的腹部切口。
9. 将一对镊子的尖端插入肌肉和皮肤之间，以准备移植（图1B，视频1）。
10. 插入睾丸或包含一小部分邻近组织的睾丸增生的片段（图1C，视频1）。
11. 将受体斑马鱼转移到含有0.4x PBS，补充有10μg/ml庆大霉素的槽中
12. 用铝箔包裹水箱，以防止光线进入，并将水箱在26°C下孵育4天，以促进伤口愈合。
13. 手术后4天后移植鱼。
  
  图1.皮下移植的视图 A.准备受体鱼。通过用湿纸巾覆盖头部和尾部来保护受体鱼免受干燥。 B.皮肤和肌肉的分离。插入的镊子（箭头）将腹部肌肉与受体鱼的皮肤分开。 C.移植的睾丸片段的视图。将睾丸碎片（箭头）插入（B）中所示的处理区域。比例尺= 5mm。
  
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  视频1.皮下移植手术
  
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系列移植睾丸增生
1. 在睾丸增生移植物生长之后，用0.01％对氨基苯甲酸乙酯麻醉受体。
2. 取出睾丸增生并转移到含有L-15培养基的60mm培养皿中
3. 将移植物切成大约10个相等大小的碎片。
4. 为了确认睾丸增生移植物的状况，留出几个片段用于组织学
5. 如程序A：皮下移植中所述，重新移植其余的含有增生表皮的碎片。

数据分析

我们使用4种睾丸增生进行了总共156例连续移植，并且在149例中观察到移植移植物的生长，包括先前报道的数据（数据呈现在Kawasaki等人，2016 ）。我们已经成功地在最长时间内维持了超过3年的睾丸增生（数据呈现在Kawasaki等人，2016）。图2显示通过连续移植超过一年的额外睾丸增生的树图。然而，在睾丸增生的连续移植中非常偶然地出现恶性转化和睾丸-ova（数据呈现在Kawasaki等人，2016）。因此，应当在每一代中进行移植的睾丸增生的组织学观察，以避免不希望的转化。

图2.通过连续移植维持睾丸增生。A.睾丸增生移植片段的生长。箭头指示移植的移植物。比例尺= 5mm。 B.睾丸增生的连续移植的树图。每个框显示移植片段的数目，受体存活的数目超过1个月，以及在每个移植步骤中生长的移植物的数目。注意，在1-1的情况下移植的原始睾丸增生的片段（左侧照片）在第一次移植后保持458天，并且所有移植物在第二次移植中再次生长。比例尺= 5mm。 C.嫁接增生的组织学观察。每个睾丸增生的切片对应于（B）中所示的移植物。虽然每个阶段的精子细胞的比例似乎改变，精子发生通过连续移植维持。箭头，精原细胞PC，精母细胞; SP，精子。比例尺=20μm。

食谱

10％对氨基苯甲酸乙酯储备液
将5g对氨基苯甲酸乙酯溶于50ml乙醇中
0.01％对氨基苯甲酸乙酯工作溶液将50μl10％的对氨基苯甲酸乙酯原液溶解在50ml的饲养水中。
0.4x含有10μg/ml庆大霉素的PBS 将16ml 25x PBS和1ml庆大霉素储备溶液（10mg/ml）混合在983ml高压灭菌饲养水中

致谢

这项工作得到日本教育，文化，体育，科学和技术部赠款援助部分（资助号23570260,25251034和25114003）的支持。该协议改编自以前的工作（Kawasaki等人，2016）

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