材料和试剂

微量离心管，1.7ml（Coring，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
1.5ml带盖的Bioruptor Pico微管（Diagenode，目录号：C30010016）
可选：D1000胶带和试剂（Agilent Technologies，目录号：5067-5582; 5067-5583）
DNeasy Blood& Tissue Kit（QIAGEN，目录号：69506）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
CutSmart缓冲液（New England Biolabs，目录号：B7204S）
RNase（无DNA酶）（Roche Diagnostics，目录号：11119915001）
水（已经高压灭菌的双去离子水）
注意：本协议中使用的所有水都是指双重去离子水，随后进行高压灭菌。或者，可以使用购买的DNAse游离水。
dsDNA HS测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：Q32854）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3059）
dA 6m 抗体（Synaptic Systems，目录号：202011/202111/202003）
Dynabeads 蛋白A（Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM，目录号：10008D）
糖原（Roche Diagnostics，目录号：10901393001）
NaOAc（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10010500）
异丙醇（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10315720）
乙醇绝对（VWR，目录号：20821330）
TruSeq Nano DNA LT文库制备试剂盒（A或B组）（Illumina，目录号：FC-121-4001或FC-121-4002）
Tris-HCl（Melford Laboratories，目录号：B2005）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10428420）
Igepal CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
N 6 - 甲基腺苷5'-单磷酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：M2780）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10213570）
干冰
5x DIP IP缓冲区（参见配方）
1x DIP IP缓冲区（参见配方）
DIP洗脱缓冲液（参见配方）

设备

孵化器（格兰特，干式加热系统）
旋转轮（Bibby Scientific，Stuart，型号：旋转器SB3）
热混合器（Eppendorf，型号：Thermomixer compact）
Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：Q32857）
注意：此产品已停产。
水浴超声仪（Diagenode，Bioruptor Pico，目录号：B01060001）
微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424）
Vortex（Scientific Industries，型号：Vortex-Genie 2）
磁铁（Thermo Fisher Scientific，DynaMag ^TM，目录号：12321D）
可选：2200 Tapestation（安捷伦科技公司，目录号：G2965A）

程序

该程序可以分为三个部分：'A'分离基因组DNA，'B'超声和'C'DNA免疫沉淀dA <6m 。程序的概要如图1所示。我们鼓励使用至少两个生物复制品和至少2种不同的dA 6m抗体进行所有实验。作为进一步的对照，可以在E上进行DNA免疫沉淀过程。大肠杆菌细菌DNA，如原始工作（Koziol等人，2015）中所述。野生型细菌可以用作阳性对照，因为它们的dA 6m 位点是公知的。作为阴性对照，可以使用Dam dA ^{6m 甲基化酶缺陷的细菌。这样的细菌在序列GATC内不再具有脱氧腺苷甲基化，并且总体上具有减少数目的dA 6m位点。然后可以通过观察其dA 6m信号中的两个细菌基因组之间的显着差异，特别是通过dA ^{的减少来获得dA 6m 的DNA免疫沉淀的成功> <6m}（Koziol等人，2015）。

图1. dA ^{6m DNA免疫沉淀的图示。分离基因组DNA，通过RNA酶处理消除任何RNA。接下来，使用针对dA 6m的抗体，通过DNA免疫沉淀将DNA片段化和富集。然后可以通过随后的深度测序分析富集的级分。}}

基因组DNA分离
1. 使用DNeasy Blood&组织试剂盒，按照制造商的指导，但有例外：用177μlPBS，而不是AE缓冲液（10mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，pH9.0）洗脱DNA。接下来，再次向柱中加入177μlPBS，并洗脱。收集两个部分在同一管，使总共354微升。
  注意：任何提取基因组DNA的方法都可以在该步骤中使用，只要获得至少5μg的DNA即可。如果使用另一种基因组DNA提取方法，请确保稀释基因组DNA，使最终体积为354μl。在该体积中，DNA的浓度应至少为14ng /μl。
2. 加入40μlCutSmart缓冲液。
3. 添加6微升的RNase DNase-free。
4. 在37℃孵育过夜。
  注意：孵育至少6小时，以确保RNA的良好降解。 RNA含有甲基化的腺苷，抗体也可以识别。因此，RNA的存在可能抑制甲基化脱氧腺苷从DNA的回收，使得去除是重要的。
5. 将样品分成两份，并清理基因组DNA：使用DNeasy Blood& Tissue Kit，按照制造商的方案"DNeasy Blood& Tissue Kit'，用177μlPBS代替AE缓冲液洗脱DNA一次。
  注意：此柱清洁步骤有助于更好地从样品中消除RNA。需要拆分为两列，因为否则需要加载的卷超过列容量。
6. 合并两个相应的样品。
7. 加入40μlCutSmart缓冲液。
8. 加入2μl无RNase DNA酶
9. 在37℃孵育至少2小时注意：此额外的RNase步骤可确保大部分RNA被降解。
10. 将样品分成两份，并清理基因组DNA：使用DNeasy Blood& Tissue Kit，按照制造商的指南，用200μl水代替AE缓冲液洗脱DNA一次。
  注意：需要拆分为两列，否则需要加载的卷超过列容量。
11. 合并两个相应的样品。
12. 按照制造商的指南，使用Qubit荧光计和Qubit dsDNA HS测定试剂盒定量基因组DNA含量。
  注意：我们建议不要使用Nanodrop进行定量，因为这不会导致可靠的定量。在这一点上，可以停止方案并且可以冷冻DNA。我们建议在-20°C或更冷的储存。
基因组DNA的超声处理
1. 取5微克的基因组DNA，并转移到1.5毫升Bioruptor Pico微管。
2. 用水调节体积至300μl。
3. 在4℃下，在Diagenode Bioruptor Pico中超声处理35个循环，30秒开/30秒关闭。一个代表性的例子如图2所示。
  注意：根据所使用的机器和基因组DNA，需要优化超声处理时间。我们的目标是使DNA片段大小达到峰值在约150-300个碱基对。
4. 使用D1000胶带和试剂，按照制造商的方案验证基因组DNA与Tapestation的片段化注意：作为Tapestation的替代，基因组DNA可以在琼脂糖凝胶上运行，以在超声处理后验证片段大小。
dA ^6m DNA免疫沉淀
1. 取每个样品300 ng的超声处理的基因组DNA。这将是深度测序的输入控制，并且不会用于下述的DNA免疫沉淀过程。储存于-20°C直至需要
2. 取3μg的超声处理的基因组DNA，并加入到1.7ml微量离心管中。
3. 将管置于冰上。
4. 在冰上，加入200μl5x DIP IP缓冲液
5. 在冰上，加入200μl30μg/μlBSA储备液
6. 在冰上，用水将总体积调节至1ml
7. 短暂涡旋约2秒，然后放在冰上
8. 加入5μl0.5μg/μldA ^6m抗体原液
9. 立即通过转动管子并将管子放回冰上轻轻混合。
10. 通过涡旋混合磁性蛋白A珠，使所有珠重新悬浮
11. 取100微升混合磁性蛋白A珠每个样品，并添加到新的1.7毫升微量离心管
12. 放在磁铁上，等待1分钟，磁珠粘在管子一侧。
13. 从珠子上除去上清液。
14. 从磁铁上去除珠子。
15. 向珠子中加入1ml 1x DIP IP缓冲液，轻轻混匀
16. 重复步骤C11-C14至少两次以上。
17. 放在磁铁上，等待1分钟，磁珠粘在管子一侧。
18. 从珠子上除去上清液。
19. 将珠子重悬于105μl1x DIP IP缓冲液中
20. 加入105μl30μg/μlBSA储备液。
21. 在4℃下将珠子分别在转轮上孵育。
  注意：珠子和样品在单独的试管中孵育。
22. 将样品分别在4℃的转轮上孵育。
23. 过夜孵育后，向每个样品中加入200μl珠悬浮液
24. 将样品珠混合物在4℃下在旋转轮上孵育至少一个多小时
25. 将样品放在磁铁上，等待1分钟，磁珠粘在管子一侧。
26. 清除珠粒上的所有上清液。
27. 从磁铁上去除珠子。
28. 向珠子中加入1ml 1x DIP IP缓冲液，轻轻混匀
29. 重复步骤C23-C26至少三次以上。
30. 将样品放在磁铁上，等待1分钟，磁珠粘在管子一侧
31. 除去珠粒中的所有上清液。
32. 加入200μlDIP洗脱缓冲液。
33. 漩涡
34. 将样品在42℃下在Thermomixer中至少1小时，以1400rpm
35. 向下旋转样本。
36. 将样品放在磁铁上，等待1分钟，磁珠粘在管子一侧
37. 将上清液从珠子转移到新的1.7毫升微量离心管中注意：您可以丢弃珠子。
38. 向回收的上清液中加入300μl水
39. 加入2微升糖原。
40. 加入50μl的3M NaOAc的储备液。
41. 加入500μl异丙醇。
42. 漩涡
43. 置于干冰上直至冷冻。
44. 最高速度离心30分钟。
  注意：沉淀应该形成，其含有dA ^6m富集的DNA。
45. 除去上清液。
46. 用1ml 70％乙醇洗涤沉淀两次。
47. 清除任何液体。
48. 让颗粒在室温下干燥5分钟
49. 重新悬浮在所需量的水中。
  注意：我们通常在约10-50微升
  重悬
50. 按照制造商的指南，使用Qubit荧光计和Qubit dsDNA HS测定试剂盒定量基因组DNA含量。
  注意：此步骤是必需的，以确保您已实际获得基因组DNA与下拉。我们通常希望获得至少10 ng的基因组DNA。
51. 使用步骤C47的所有基因组DNA和步骤C1的相应输入对照制备标准深度测序文库注意：尽管任何标准深度测序都是可能的，但我们建议使用TruSeq Nano DNA LT文库制备试剂盒（A或B组）用于制备适合Illumina测序的文库，例如HiSeq 2500或HiSeq 4000。

数据分析

在已经应用该方法的原始研究论文中提供了关于数据处理和分析，重复，独立实验，可重复性（包括所应用的任何统计学测试）的任何信息（Koziol等人，2015）。

代表数据

图2.超声处理后基因组DNA断裂模式的分布。使用Diagenode超声仪，将5μg基因组DNA在300μl的体积中片段化35分钟。通过Tapestation分析，用D1000 Tapestation试剂测定基因组DNA的大小。在该样品中，断裂的DNA的峰被确定为245bp。还示出了下部和上部标记。

笔记

我们已经发现这个协议是非常鲁棒和可重复的。我们总是能够富集dA 6m 并且为随后的标准深度测序文库获得总是足够的DNA。如果该方法不能产生足够的或没有DNA，我们没有遇到过，请重复实验，也许用新鲜的抗体批次。
我们测试了3种不同的dA 6m抗体用于在真核基因组中富集dA 6m 。所有这些都在上面列出。我们已经发现，它们都具有可重复和重叠的结果（Koziol等人，2015）。因此，我们相信任何这些抗体都会工作。然而，我们鼓励使用至少两种不同的dA ^6m抗体来确认任何初始结果，以对结果具有更高的置信度。

食谱

注意：在开始之前准备储备溶液中所有的新鲜溶液，并保持冰冻。

5x DIP IP缓冲区
加入指定量至7.5ml水
0.5ml 1M Tris-HCl（pH7.4）贮液 1.5ml 5M NaCl储液
0.5ml 10％vol/vol Igepal CA-630原料
1x DIP IP缓冲区
将10ml 5x DIP IP缓冲液与40ml水混合
DIP洗脱缓冲液
为每个样品添加指示量，根据样品数量
按比例增加 45μl5×DIP IP缓冲液
75μl20mM N 6 - 甲基腺苷5'-单磷酸钠盐储液
105微升水

致谢

该方案用于以前在Nature Structural and Molecular Biology（Nature Science and Molecular Biology）（Koziol等人，2015）中发表的工作。 M.J.K.得到长期人类前沿奖学金（LT000149/2010-L），医学研究委员会奖学金（G1001690）和以撒牛顿信托奖学金（RG76588）的支持。该工作由生物技术和生物科学研究委员会授予BB/M022994/1（M.J.K.）赞助。进行这项工作的Gurdon实验室由来自Wellcome Trust的101050/Z/13/Z资助，由Gurdon Institute核心资助，即惠康信托核心资助（092096/Z/10/Z）和Cancer Research UK Grant（C6946/A14492）。 C.R.B.和G.E.A.由Wellcome Trust核心赠款资助。我们感谢S. Moss和K. Harnish对深度测序的建议和帮助，他们都得到了Gurdon Institute核心资助。我们感谢Nigel Garrett的批评性评论。本文报道的该方案是从用于检测RNA中腺苷甲基化的现有方法建立的（Dominissini等人，2013）。

参考文献

Dominissini，D.，Moshkovitz，MS，Divon，SM，Amariglio，N.and Rechavil，G。（2013）。 ^{- 甲基腺苷通过基于免疫捕获和大规模平行测序的 A-seq。 Nature Protocols 8（1）：176-189。}

Koziol，MJ，Bradshaw，CR，Allen，GE，Costa，AS，Frezza，C.and Gurdon，JB（2016）。在脊椎动物中甲基化脱氧腺苷的鉴定显示出DNA修饰的多样性。 Nat Struct Mol 23（1）：24-30