材料和试剂

Costar 24孔透明TC处理的多孔板（Corning，Costar ，目录号：3527）
1.5 ml Eppendorf管
HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10569-044）
胎牛血清（FBS）（Gemini Bio Products，目录号：100-106）
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml;10,000μg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140-163）
Pro-IL-1β-标志，NLRP3-Flag，ASC1-Flag，半胱天冬酶-1标志和NEK7-HA质粒。注意：通过标准PCR技术扩增Pro-IL-1β，NLRP3，ASC1，半胱天冬酶-1和NEK7，随后使用In-Fusion？HD克隆试剂盒根据制造商的说明书将其插入哺乳动物表达载体中点击这里查看详细的协议，Shi等人，2016）。所有质粒都提交给Addgene。
pCMV-pro-IL1β-C-Flag（Addgen，目录号：75131）
pcDNA3-N-Flag-NLRP3（Addgen，目录号：7512??7） pcDNA3-N-Flag-ASC1（Addgen，目录号：75134）
pcDNA3-N-Flag-Caspase-1（Addgen，目录号：7512??8） pcDNA3-N-HA-NEK7（Addgen，目录号：75142）
IL-1βELISA试剂盒（affymetrix，eBioscience，目录号：88-7013-76）
Plasmid Plus Midi Kit（QIAGEN，目录号：12943）
LB培养基（MP Bio，目录号：3002-31）
Opti-MEM （Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：51985-034）
Lipofectamine 2000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：11668-019）
尼日利亚霉素（Sigma-Aldrich，目录号：N7143-10MG）
乙醇
SuperSignal ^TM West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）
DMEM细胞培养基（见配方）
尼日利亚储备液（见配方）

设备

37℃，5％CO 2强制空气培养箱（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，型号：Sanyo Incubator Panasonic MCO-19AIC（UV）CO 2） />
摇床培养箱（Eppendorf，型号：New Brunswick I24）
移液器（Mettler-Toledo，ShopRainin）
微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424）
ELISA板读数器（Bio Tek Instruments，型号：Synergy Neo2多模式读数器）
分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，型号：NanoDrop 2000c分光光度计）

软件

GraphPad Prism 6软件（ http://www.graphpad.com/科学软件/棱镜/）

程序

在1.5ml Eppendorf管中，在每孔100μlOpti-MEM中稀释1.5μlLipofectamine 2000。

在1.5ml Eppendorf管中，稀释前IL-1β-标志（200ng /孔），ASC（20ng /孔），胱天蛋白酶原-1（100ng /孔），NLRP3（200ng /孔） NEK7（200ng /孔）质粒在100μlOpti-MEM中注意：避免转染超过ASC质粒指示的量。过量的ASC促进自身聚集并诱导NLRP3依赖性胱天蛋白酶-1激活。

将稀释的DNA加入到稀释的Lipofectamine 2000（1:1比例）中，在室温下孵育5分钟，然后将DNA-脂质复合物加入到0.5ml DMEM细胞培养物中的HEK293T细胞中中等

转染后24-36小时，用250μlDMEM细胞培养基更换培养基

培养基更换后6-12小时收集上清液

可选：为了刺激NLRP3炎症小体，在上清液收集（步骤7）之前1小时可以将10μg/ml尼日利亚菌素直接加入到250μlDMEM培养基中。

ELISA（或Western印迹）来测定上清液中成熟IL-1β的量。根据制造商的说明进行ELISA。
注意：当使用Western印迹检测成熟IL-1β时，上清液不需要浓缩。通过SuperSignalTM West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）可以检测15μl上清液中的成熟IL-1β。

数据分析

ELISA数据应从最少两次独立实验收集，每次处理至少重复3次。图1显示了将所示质粒转染到HEK293T细胞中后的代表性ELISA数据。样品之间的差异的统计学显着性可以用GraphPad Prism 6软件和Student's t-检验（未配对，双尾）确定。 P 值< 0.05被认为具有统计显着性

图1.来自重建的HEK293T细胞的分泌的IL-1β的水平。每个样品中的转染组分在X轴下方指示。将每种HEK293T细胞培养物样品的50μl上清液用于IL-1βELISA。使用GraphPad Prism 6软件绘制代表性数据。

食谱

DMEM细胞培养基
将500ml DMEM与50ml FBS和5ml青霉素 - 链霉素（10,000U/ml;10,000μg/ml）混合
在4°C储存，直到使用
尼日利亚储备液
将10 mg尼日利亚菌素溶解在1 ml纯乙醇中，然后充分混匀
储存于-80℃直至使用

致谢

该方案改编自先前公开的研究，Lu等人。（2012），并由Shi等人进行。（2016年）。这项工作得到了美国国家卫生研究院（U19 AI100627）的支持。

参考文献

Arend，WP，Palmer，G。和Gabay，C.（2008）。 IL-1，IL-18和IL-33家族的细胞因子。 Immunol Rev 223：20-38。

Gross，O.，Thomas，CJ，Guarda，G.and Tschopp，J.（2011）。 inflammasome：综合视图 Immunol Rev 243（1）：136-151。

He，Y.，Zeng，MY，Yang，D.，Motro，B.和Nú?ez，G。（2016）。 NEK7是NLRP3激活下游钾流出的必要介质。 530（7590）：354-357。

Lu，B.，Nakamura，T.，Inouye，K.，Li，J.，Tang，Y.，Lundback，P.，Valdes- Ferrer，SI，Olofsson，PS，Kalb，T.，Roth， Zou，Y.，Erlandsson-Harris，H.，Yang，H.，Ting，JP，Wang，H.，Andersson，U.，Antoine，DJ，Chavan，SS，Hotamisligil，GSand Tracey，KJ（2012）。 PKR在炎症小体激活和HMGB1释放中的新作用。/a> 自然 488（7413）：670-674。

Schmid-Burgk，JL，Chauhan，D.，Schmidt，T.，Ebert，TS，Reinhardt，J.，Endl，E。和Hornung，V。（2016）。全基因组CRISPR（聚簇定期间隔短回文重复序列）筛选鉴定NEK7是NLRP3炎症小体激活的必要组分。 J Biol Chem 291（1）：103-109。

Shi，H.，Wang，Y.，Li，X.，Zhan，X.，Tang，M.，Fina，M.，Su，L.，Pratt，D.，Bu，CH，Hildebrand，，S.，Scott，L.，Quan，J.，Sun，Q.，Russell，J.，Arnett，S.，Jurek，P.，Chen，D.，Kravchenko，VV，Mathison，JC，Moresco，EM ，Monson，NL，Ulevitch，RJ和Beutler，B。（2016）。 NLRP3激活和有丝分裂是由NEK7（一种新的炎症组件）协调的互斥事件。 Nat Immunol 17（3）：250-258。