材料和试剂

2 ml microfuge安全密封锁帽管（SARSTEDT，目录号：72-695-500）
1.5 ml microfuge安全密封锁帽管（SARSTEDT，目录号：72-690-001）
成熟干种拟南芥（哥伦比亚生态型-0）种子
液氮
HPLC级甲醇（Merck Millipore，目录号：67-56-1）
HPLC级氯仿（Merck Millipore，目录号：67-66-3）
HPLC级水（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：7732-18-5）
吡啶（Merck Millipore，目录号：110-86-1）
DL-正亮氨酸内标（Sigma-Aldrich，目录号：N1398）
甲氧基胺盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：226904）
N，N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）（Sigma-Aldrich，目录号：24589-78-4）
n - 烷烃混合物（参见配方）
十二烷（C12）（Sigma-Aldrich，目录号：44010） - 十五烷（C15）（Sigma-Aldrich，目录号：76509）
正十八烷（C18）（Sigma-Aldrich，目录号：74691）
- 十九烷（C19）（Sigma-Aldrich，目录号：74158）
- 二十二烷（C22）（Sigma-Aldrich，目录号：43942）
（C28）（Sigma-Aldrich，目录号：74684）
三十二烷（C32）（Sigma-Aldrich，目录号：44253）
n - 高三十烷（C36）（Sigma-Aldrich，目录号：52919）
含有DL-正亮氨酸内标溶液（见配方）的预冷（4℃）提取缓冲液
甲氧胺盐酸盐衍生试剂（参见配方）
n - 烷烃时间标准混合解决方案（参见配方）
N-甲基-N，N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生化试剂+预混合的正 - 烷烃时间标准（参见配方）。

设备

真空干燥器
液氮杜瓦瓶
台式离心机（能够在4℃达到20,817×g）（Eppendorf）
桌面涡流（Benchmark Scientific Inc.）
CentriVap台式离心真空浓缩器（Labconco）
台式多Therm热摇床（Benchmark Scientific Inc.）
与质量选择检测器和Gerstel多用途取样器MPS2S（或任何其他GC-MS系统）相连的GC-MS系统（Agilent Technologies，型号：7890A）
DB-5ms毛细管柱（30m，0.25mm i.d.和0.25μm厚度）（或任何其他适用于初级代谢图谱的柱）（Agilent Technologies，目录号：122-5532G）
VF-5ms毛细管柱（30m + 10m EZ-guard，0.25mm i.d.和0.25μm厚度）或适用于初级代谢图谱的任何其它柱（Agilent Technologies，目录号：CP9013）
10 mm认证的清除螺纹螺纹套件：2毫升Thermo Scientific 国家^TM 10毫米宽开口螺纹小瓶和由透明玻璃+ PTFE /硅胶隔片制造的插入件（Thermo Fisher科学，目录号：CERT4010-91）。
200μlMicroSert玻璃插入物（31×5mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：C4012-465）
1 ml透明玻璃高回收反应瓶，附有13-425开口酚醛螺旋盖+ PTFE /硅胶隔片（WHEATON，目录号：W986294NG）
20ml预装配的EPA小瓶+ PTFE螺旋盖（Thermo Fisher Scientific，目录号：B7800-20）

程序

从拟南芥种子中提取代谢物（图1A1-1A8）
1. 重量20mg成熟干种拟南芥种子，并将其放入2ml锁帽微量离心管中（图1A1）。在干燥期结束时完全成熟收获种子。收集后，使种子在真空干燥下完全干燥另外3天。请参见注1，了解种子原料，干燥过程和重复建议。
2. 将小金属研磨球插入每个管中，并将管置于液氮中（图1A2）
3. 将管插入4°C预冷球磨塑料适配器，并立即将适配器放置在球磨机中。在24Hz下均匀化样品4分钟，并将样品转移回液氮（图1A3）。
4. 加入1ml含有DL-正亮氨酸内标（见Recipes）的4℃预冷却的提取缓冲液并剧烈涡旋（图1A4）。有关安全建议，请参阅注释2
5. 在4℃预冷却的台式离心机上在20,817×g离心样品10分钟。该步骤允许分离极性上清液（甲醇/水）和非极性（氯仿）相（图1A5）。
6. 收集上清液到新的2毫升锁帽微量离心管，加入300微升的HPLC级氯仿和300微升的HPLC级水。大力涡旋每个样品10秒，以使水和氯仿充分混合，并在4℃预冷却的台式离心机上在20,817×g离心10分钟（图1A6）。
7. 从上清液收集300微升等分试样到新的1.5毫升锁帽微量离心管（图1A7）。
8. 在这个阶段，300μl等分试样可以立即转移到-80℃用于未衍生化的分析（图1A8 1）。在发生衍生化的情况下，使用CentriVap台式离心真空浓缩器在25℃下干燥300μl等分试样5-6小时（图1A8 2）。
  
  图1.拟南芥种子提取代谢物的工作流程
使用甲氧胺盐酸盐和N，N-甲基-N'-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）试剂（图2B1-2B5）进行衍生化
1. 通过将沉淀重悬于40μl甲氧胺盐酸盐溶液中（见配方2）（图2B1），将干燥的等分试样甲氧基化。
  注意：甲氧基胺盐酸盐试剂是极毒性的，因此，衍生化过程必须在通风橱中以最高的谨慎处理。
2. 将全部样品转移到反应瓶中（图2B2）。
3. 孵育反应瓶在37℃下2小时，以保护羰基部分（图2B3）。
4. 通过加入70μl含有预混合的正 - 烷烃时间标准的N，N-甲基-N，N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）来处理三甲基甲硅烷基化物酸性质子Recipes）并在37℃下孵育反应小瓶30分钟（图2B4）。添加n n - 烷烃允许确定保留时间指数。
  注意：MSTFA试剂毒性极大，因此，必须在通风橱内最高度谨慎地处理衍生化过程。
5. 在室温下冷却反应瓶，将全部样品（约110μl）转移到置于GC-MS运行瓶中的插入物中（图2B5）。
  
  图2.衍生过程的工作流程
GC-MS分析（图3C）
1. 在与质量选择性检测器（Agilent，型号：5975c）和Gerstel多用途采样器MPS2S（图3C）偶联的GC-MS系统（Agilent，型号：7890A）上进行分析。在表1所述的条件下进行分析，由此使用DB-5ms毛细管柱（与duraguard，DG一起）来量化可溶性和蛋白质结合的氨基酸，并且使用VF-5ms毛细管柱来定量糖，糖酸，糖醇，三羧酸（TCA）循环中间体和有机酸。使用VF-5ms毛细管柱，因为它可以达到更高的温度，从而允许在色谱仪中更好地分离代谢物。
  
  图3. GC-MS运行和数据分析的工作流程
  
  表1. GC-MS代谢物分析条件
数据分析（图3D）
1. 使用Agilent GC/MSD Productivity ChemStation软件包进行峰检测，峰积分和保留时间校正（ http ：//www.agilent.com ）。
2. 将相应的质谱和保留时间指数与可从国家标准和技术研究所获得的标准物质和市售电子质谱库进行比较（ http://www.nist.gov/）和马克斯普朗克植物生理学研究所，德国（ http://www.mpimp-golm.mpg.de/）。
3. 将整合的质量峰（m/z）片段针对DL-正亮氨酸内标信号进行标准化。 DL-正亮氨酸内标的相对峰在所有样品中应具有相似的高度/面积（参见图4中代表性的离子色谱图）。
4. 在内标标准化之后，基于计算的每种代谢物的相对峰面积，从代谢物数据集中排除异常值。图5中显示的代表性总离子色谱（TIC）显示来自野生型拟南芥（Colombia-0）的种子与两个转基因品系的重叠色谱图的差异峰面积。
  
  图4.野生型拟南芥种子（生态型哥伦比亚-0）和来自两个转基因品系的种子的代表性离子色谱图。离子色谱图（大正方形）显示DL-正亮氨酸内标的特征性158m/z 质量片段（小正方形） />
  
  图5.野生型拟南芥种子（生态型哥伦比亚-0）和来自两个转基因品系的种子的代表性总离子计数（TIC）色谱图。显示了差异在野生型和转基因品系之间的各种峰

笔记

在拟南芥的情况下，可以在干燥结束时，通常在土壤上发芽后4-6周（取决于灌溉光和湿度生长条件）从完全成熟的植物收集成熟干种子。 WT生态型和突变体系可以通过若干不同的公共种子收集物进行排序，例如SALK生物研究所（ http://www.salk.edu/）或RIKEN（ http://www.riken.jp/en/）。可以在T-DNA Express：Arabidopsis基因映射工具（ http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress ）或拟南芥信息资源（ https://www.arabidopsis.org/））。我们建议在真空下干燥种子，在烘箱中加热干燥可能会诱发过于苛刻的条件，引发一些代谢变化。我们建议每个基因型/治疗至少使用5个生物学重复。除了生物复制品，至少应制备一个不含生物材料的空白样品，并进行所有提取和衍生化方案。

提取缓冲液和甲氧胺盐酸盐和MSTFA衍生化试剂都是极其有毒的，因此，除了种子取样和加重程序外，所有的提取和衍生化过程必须在通风橱下非常小心地进行。

食谱

含有DL-正亮氨酸内标溶液的预冷（4℃）提取缓冲液

制备HPLC级甲醇，HPLC级氯仿和HPLC级水（v：v：v）的2.5：1：1混合物。提取缓冲液必须在提取前新鲜制备。
为制备DL-正亮氨酸内标溶液，将2mg DL-正亮氨酸溶于1ml HPLC级水中并剧烈涡旋。混合7μl内标每1毫升提取缓冲液。
内部标准管在未使用时应储存在-20°C。内部标准允许在萃取过程中材料损失的情况下峰的归一化

甲氧胺盐酸盐衍生化试剂

在室温下将20mg甲氧基胺盐酸盐溶于1ml吡啶中
该试剂需要在实验前新鲜配制

n - 烷烃时间标准混合解决方案

在具有Teflon螺旋盖的单独的20ml玻璃小瓶中（表2），将2μl或2mg的可溶性或固体n-烷烃分别溶解在1ml吡啶中。
为了制备 n' - 烷烃时间标准混合溶液，将500μl从各C 12至C 32正链烷烃溶液转移至500μl，并从C 36 em- （在该浓度下可以更好地观察到C 36峰）加入新的20ml玻璃瓶中并剧烈涡旋（表2）。
所有单独的 n - 烷烃瓶和 n -alkanes时间标准混合溶液瓶在未使用时应储存在-20°C。

表2.准备 - 烷烃时间标准混合解决方案

N-甲基-N，N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生化试剂+预混合的正 - 烷烃时间标准
计算分析所需的MSTFA的量（每个样品70μl），并将7μl每70μlMSTFA预混合的正 - 烷烃时间标准混合溶液直接加入MSTFA混合物中。 n - 烷烃时间标准混合溶液应在70℃下轻轻预热，然后加入MSTFA混合物。
注意：该试剂需要在实验前新鲜配制。例如：50个样品的实验需要3.5ml的MSTFA（70μl×50个样品）与350μl的预热的正烷烃时间标准混合溶液（7μl×50个样品）混合。

致谢

这是在Cohen等人中进行的分析的详细方案。（2014年）。两者基本上都是基于Lisec 。（2006），其中对拟南芥种子进行了修饰。我们要感谢以色列科学基金会支持这项研究（ISF拨款＃231-09和＃1004/15）。

参考文献

Cohen，H.，Israel，H.，Matityahu，I.和Amir，R。（2014）。拟南芥中CYSTATHIONINE-γ-SYNTHASE的反馈不敏感形式的种子特异性表达刺激与干燥胁迫相关的代谢和转录组反应。植物生理学 166（3）：1575-1592

Lisec，J.，Schauer，N.，Kopka，J.，Willmitzer，L。和Fernie A.R. （2006）。基于气相色谱质谱法的代谢物分析在植物中。 Nat Protoc 1（1）：387-396