材料和试剂

8孔玻片（例如，，， TM Lab-Tek Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：154534）
指甲油（无色，市售）
盖玻片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：Q10143263NR1）
肿瘤细胞系
注意：在本方案（ATCC，德国）中使用HCT-116p53/wt。
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26140079）
Dulbeccos的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8662）
胰蛋白酶-EDTA溶液，0.25％，无菌过滤（Sigma-Aldrich，目录号：T4049）
用碳酸氢钠改性的不含L-谷氨酰胺的McCoy's 5A培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M8403）
甲醛溶液（37％）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
核染色试剂（颜色取决于二次染色）

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），蓝色（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：62247）}
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物，蓝色（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ，目录号：H3570）
DRAQ5 TM荧光探针溶液（5mM），红色（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：62251）
碘化丙锭（PI），红色（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：P21493）

Vectashield封固剂（Vector Laboratories，USA）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
生长培养基（见Recieps）
3.7％甲醛溶液（见配方）
渗透溶液（参见配方）

设备

细胞培养显微镜（例如，Carl Zeiss，Vienna，Austria）
移液器
血细胞计数器（例如，Bürker-Türk）（BRAND，目录号：719505）
离心机（例如，Eppendorf，德国）
37℃，5％CO 2培养箱
共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss，型号：LSM 800）

软件

LSM800的软件：ZEN lite（免费下载，查找' www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-software/zen-lite.html '）

程序

在细胞培养板中维持细胞在补充有10％胎牛血清的McCoy's 5A培养基中，直到细胞70-80％汇合。
用PBS洗涤细胞一次，通过加入1ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶处理细胞，孵育3-5分钟，直到细胞在显微镜下漂浮。
加入5-10 ml生长培养基，用移液管混合，用血细胞计数器计数细胞
种子细胞在室滑片上具有合适的接种密度。用于汇合室载玻片的细胞数目将随细胞类型而变化。对于该实验，我们使用在4室载玻片中具有2×10 4个细胞/孔的接种密度的HCT-116。
允许休息24小时或根据需要在37℃，5％CO 2的培养箱中处理细胞24-72小时。
用1ml 37％甲醛在9ml1×PBS中制备甲醛溶液，得到3.7％的甲醛终浓度。该溶液应在使用前立即制备。
注意：甲醛是有毒的。使用本化学品前请阅读MSDS。应佩戴手套和安全眼镜，并在通风橱内制作解决方案。
第二天或治疗后，用冰冷的PBS洗涤细胞两次，并用200-300μl3.7％甲醛溶液在冰上固定10分钟。
然后，用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟，室温（室温）
通过用透化溶液在室温覆盖细胞10分钟来透化细胞
用PBS洗涤细胞两次。
任选：随后，用阻断剂进行阻断细胞，用抗体染色细胞
然后，在暗处，在RT下，用DAPI，PI，Hoechst 33342或DRAQ5分别除去上清液和染色细胞，最终浓度为1μg/ml，持续15-30分钟。
注意：

488，FITC，GFP）和红色（Alexa Fluor ^{mCherry，mKate-2）荧光团。对于活细胞染色，Hoechst 33342染料是一种流行的细胞渗透性核复染剂。}
可选：使用包括0.5μg/ml DAPI（Vector Laboraties，USA）的vectashield封固剂，不需要核染色步骤。继续执行第15步。

用PBS冲洗，小心地从幻灯片中取出试剂盒。
让幻灯片干燥2-3分钟。
用一滴安装介质安装盖玻片。
密封盖子用指甲油，以防止干燥和显微镜下的移动
使用Zeiss LSM（激光扫描显微镜）700 META显微镜激光系统和配备63x和/或100x物镜的ZEN 2010显微镜系统。
让显微镜和激光器在使用前预热15-20分钟。
用于染色的设置取决于核染色：

DAPI（激光线：405）激发/发射350/470（nm）;
碘化丙啶激发/发射535/617（nm）;
Hoechst 33342激发/发射350/461（nm）;
DRAQ5激发/发射647/681（nm）。

首先使用63x放大物镜找到核并捕获最少500个核。为了更好地解决后期桥梁，可以使用100x的目标
对于统计分析，a）有丝分裂（M），b）后期（A）和c）具有桥（AB）的后期分别计数细胞核（图1a和1b）。

图1.具有后期桥的肿瘤细胞的荧光测定。。显示了有丝分裂（M）和具有后期桥（AB）的特定后期的细胞。比例尺=10μm。 b。通过在特定细胞周期阶段扩增这些细胞核可以鉴定明显的差异。显示了不同细胞周期阶段的细胞核的代表性图像。 A.间期，B. Prometaphase，C.中期，D.后期和E.后期与桥梁。比例尺=5μm。所有细胞用DAPI染色。标记了后桥的"桥"（白色箭头）。

数据分析

后期桥的频率计算为表现后期桥的细胞的比率和计数至少100个后期的后期细胞的总数。例如，我们区分计算i）所有阶段中的所有细胞核，ii）所有细胞在有丝分裂中，iii）后期细胞，和iv）具有桥的后期（还请参见图1b）。为了统计意义，计算学生的 t 测试值注意：对于该方案，我们如先前所述（Aschacher等人，2016）用乱序siRNA或针对LINE-1 mRNA的有效siRNA处理肿瘤细胞系。有效的LINE-1 siRNA治疗在三天内引起端粒损耗，并导致后期桥（表1和图2）。

表1.后期桥梁的统计计算。给出了后期桥梁计数的代表表。至少应进行三次独立实验。

图2.后期桥的统计可视化的图示。分别给出计数核（包括间期和有丝分裂），有丝分裂，后期和具有后期桥的细胞。每个计数的数字在条的顶部给出。

食谱

生长介质
500 ml McCoy's 5A培养基
50 ml FBS，热灭活
3.7％甲醛溶液
1 ml 37％甲醛
9 ml 1x PBS
渗透解决方案
1x含0.25％Triton X-10的PBS

致谢

该协议主要是从出版物Aschacher等人修改的。（2016年）。这项工作得到了维也纳医科大学在外科研究实验室的支持。

参考文献

Aschacher，T.，Wolf，B.，Enzmann，F.，Kienzl，P.，Messner，B.，Sampl，S.，Svoboda，M.，Mechtcheriakova，D.，Holzmann，K.and Bergmann， 2016）。 LINE-1诱导 hTERT <并确保肿瘤细胞系中的端粒维持。致癌基因35（1）：94-104。

这样，我们就可以得到这样的结果：一个简单的方法是使用一个简单的方法， "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24379413"target ="_ blank"> TopBP1/Dpb11结合DNA后期桥，以防止基因组不稳定。细胞生物 204（1）：45-59。