材料和试剂

1 ml Eppendorf管
2 ml Eppendorf管 >
HPLC过滤器17mm，PTFE，0.45μm（infochroma，目录号：8817-P-4）
Cosmosil Protein-R 4.6×250mm HPLC柱（NACALAI TESQUE，目录号：06527-11）
植物组织的干提取物（例如，软木树皮）
干燥的植物提取物可以通过不同的方法获得。对于单宁的提取，建议在溶剂如甲醇，丙酮或水中浸渍细研磨组织（尺寸小于1mm）。萃取温度应在30至90℃之间，萃取时间为10至60分钟。提取物的干燥必须避免提取物尽可能多的后改性（例如氧化）。因此，建议使用真空干燥和/或冷冻干燥。干燥后，提取物应储存在冰箱（3-8°C）中，避光和空气
去离子水（18.2MΩ-cm）
2,5-二羟基苯甲酸（MALDI MS的基质物质，HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：85707）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
半胱胺盐酸盐（HPLC级）（Sigma-Aldrich，目录号：49705）
盐酸（HCl）（37％）（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
甲醇（用于HPLC）（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
丙酮（用于HPLC）（Sigma-Aldrich，目录号：270725）
三氟乙酸（TFA）（Sigma-Aldrich，目录号：302031）
乙腈（ACN）（Sigma-Aldrich，目录号：34998）
Flavan-3-ol分析标准：
（+） - 儿茶素（Sigma-Aldrich，目录号：43412）（ - ） - 表儿茶素（Sigma-Aldrich，目录号：68097）（ - ） - 高粱酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：01338）（ - ） - 表没食子儿茶素（Sigma-Aldrich，目录号：08108）
质谱校准标准覆盖约750至4000m/z（例如，Peptide calibration standard II，Bruker Daltonics，Germany）的范围。
硫解介质（参见配方）
HPLC流动相（参见配方）

设备

Eppendorf移液器1-10μl
Eppendorf移液器100-1,000μl
HPLC系统，配有UV-光电二极管阵列检测器。在我们的研究中，使用Agilent 1100 LC系统（Agilent，Waldbronn）
水浴（Polyscience，UK）
超声波浴（BANDELIN electronic，型号：Sonorex RK510）
装配有在UV波长中发射的激光的MALDI-TOF质谱仪。在我们的研究中，使用MALDI-TOF质谱仪Reflex III（Bruker Daltonics，Germany）。
分析天平
冰箱
HPLC小瓶（1ml）

程序

硫解后的HPLC-UV
1. 样品和标准品制备
  1. 将干燥的植物提取物（5mg）溶解在甲醇（5ml）中并在室温下超声处理（35kHz，250W）30分钟。
  2. 用Eppendorf移液管转移200μl溶解的提取物在Eppendorf管（2ml）中，并与200μl硫解介质混合。
  3. 将Eppendorf管置于65℃的水浴中1小时进行硫解。不需要摇动样品。在硫解过程中，缩合鞣酸的黄烷-3-醇单体单元以其天然状态（末端单元）以及它们各自的硫醚（延伸单元）释放，如图2中示意性所示。注意：只有当缩合单宁由儿茶素和/或没食子儿茶素单元组成时，硫解才有效。如果单宁是由非瑟酮醇，罗替尼诺或不同于黄烷-3-醇的单体单元组成，则交联基不会被裂解。
    
    图2.使用半胱胺盐酸盐的缩合单宁硫解方案。 R1，R2 = H或OH。
  4. 硫化用1ml水淬灭，溶液通过PTFE0.45μmHPLC过滤器纯化
  5. 通过将200μl溶解的提取物与200μl甲醇和1.0ml水顺序溶解，接着进行与硫解期间所用相同的热处理（65℃1小时），并通过PTFE0.45μmHPLC过滤器
  6. 制备黄烷-3-醇（0.01,0.02,0.05,0.10,0.25,0.50g/L，在甲醇中）的校准储备溶液。然后通过用200μl甲醇和1.0ml水依次稀释200μl校准储备溶液来制备HPLC的校准标准溶液。然后以与样品相同的方式对校准标准溶液进行热处理（在水浴中在65℃下1小时）和纯化（PTFE0.45μmHPLC-过滤器）。
  7. 将所有样品和校准标准品密封在HPLC小瓶中并储存在3-8℃的冰箱中直到分析。样品在这些条件下保持稳定约1周
2. 测量
MALDI-TOF质谱法
1. 样品制备
  1. 将干燥的植物提取物（2.5mg）溶解在1ml丙酮水溶液（50％）中并在室温下超声处理（35kHz，250W）30分钟。
  2. 通过将10mg 2,5-二羟基苯甲酸溶解在1ml纯丙酮中制备基质溶液
  3. 在Eppendorf管（1毫升）混合10微升的提取物溶液与10微升的基质溶液，并与1微升的KCl（10克/升在水中）加强，以加强形成的钾化离子和抑制形成钠化和/或其他类型的离子注意：植物组织可能含有不同种类的盐，这可能因此有助于在MALDI电离过程中的离子形成。因此，对于正确的光谱解释，确保仅形成一种类型的离子（例如，钠化的或钾化的或其它离子）是非常重要的。特别关注的是钠和钾离子，因为这两种盐是植物组织中的常见成分。 Na +和K + sup/+之间的质量差为16amu，这也是缩合单宁的结构单元之间的质量差异（表4）。因此，Na ⁺和K ⁺离子的意外形成同时可能导致光谱解释的错误。
  4. 将5μl混合物沉积在MALDI-TOF不锈钢板上，并使其在室温下干燥约1小时。
  5. 样品应在室温下储存，并在制备的同一天进行测量
2. 测量
  1. 将MALDI TOF质谱仪设置为正线性模式，监测范围为700至4,500 m/z
  2. 用校准标准品（例如，Peptide calibration standard II，Bruker Daltonics，Germany）校准MALDI TOF质谱仪。
  3. 在MALDI-TOF质谱仪上进行测量，每个样品收集约700个激光照射

数据分析

硫解后的HPLC-UV
1. 根据等式（1）校正从缩合单宁释放的每个黄烷-3-醇单体的摩尔浓度（μmol/L）（
  sub> Nth （1）
  在哪里，
  F th th =在硫解样品中黄烷-3-醇（或其硫醚）的摩尔浓度（μmol/L），
  F th N th =未硫解样品中黄烷-3-醇（或其硫醚）的摩尔浓度（μmol/L）。
  
  对于黄烷-3-醇硫醚，不需要校正，因为它们显然不作为提取物中的天然化合物存在。
  在表2中，报告了基于图3的色谱图的计算实例
  表3.来自图3的HPLC-UV色谱图的数据分析
  *注意：图3中使用的识别标签。
2. 释放的单体单元的测量量提供了缩合单宁的分子结构的以下信息（Bianchi等人，2015）：
  1. 特定黄烷醇单元（作为末端和延伸单元）的摩尔浓度的总和给出关于单宁中这种单体单元的量的指示。
  2. 存在于单宁中的不同单体单元（也作为立体异构体，如儿茶素和表儿茶素）之间的相对比例可以通过相关释放的黄烷醇之间的相对比例来估计。
  3. 可以识别终端单元的配置与扩展单元的配置之间的差异。
  4. 缩合单宁的平均聚合度（mDP）可以用公式（2）估计：
    
    在哪里，
    =总释放的黄烷-3-醇延伸的摩尔浓度（μmol/L）单元（黄烷-3-醇硫醚）硫化后，
    =总摩尔浓度（μmol/L）释放的黄烷-3-醇末端单元（天然黄烷-3-醇）硫化后对于图3中的示例，使用表2中报告的数据，计算结果如下：
MALDI-TOF质谱法
1. 包含缩合单宁的植物提取物的典型MALDI MS光谱显示在图4中。该光谱包含沿着m/z轴彼此规则地间隔开的几组峰图案。每个峰表示具有单宁单体单元的确定组成的单宁寡聚链，该单体单元的质量报告在表4中。单体单元的质量通过从单体的质量计算（图1），减去2个氢原子的质量（例如儿茶素单体单元= 290.3-2 = 288.3Da）。峰的重复图案（图4）之间的距离允许识别低聚物链中的单体单元的类型和相应类别的单宁（表4）。
  注意：MALDI-TOF分析不允许区分具有相同质量的单体单元（例如儿茶素和顺式丁胺醇）。
2. 在峰组内，距离16m/z或16m/z的倍数的峰（图4）表明在相同的缩合单宁中存在各种单体（建筑）单元，例如，没食子儿茶素（304.3Da）和儿茶素（288.3Da）。
  
  表4.不同类别的缩合单宁的典型单体单元
  
  图4.在800-2000m/z的银枞（"Abies alba"[Mill。]）树皮提取物的MALDI-TOF质谱，显示与含有儿茶素的缩合单宁相关的质量峰（或罗替尼多），没食子儿茶素和没食子酸酯
3. 可以使用公式（3）进行与MALDI-TOF光谱的峰对应的单体单元组成的识别：
  + + em>?288.3 + z ?304.3 + M _Cat + 2.0 （3）
  在哪里，
  x ， y 和 z 分别是寡聚链中的fisetinidol，儿茶素（或robinetinidol） > M 是质谱中观察到的低聚链的m/z值，
  是，K ⁺），
  2.0是在低聚链端的两个氢原子的重量在不同于黄烷-3-醇（例如，二苯乙烯）或部分（例如，，糖苷，没食子酸酯）的结构单元存在时，另外的重复峰基团在质谱中是可检测的，其从非酯化系列移动对应于非黄烷醇单元或部分的质量的间隙（Bianchi等人，2014）。如图4所示，含有没食子酸酯部分（152.1Da）的低聚物系列的存在导致与非酯化系列间隔152m/z的峰基团。在该实施例中，情况。 3应当被修饰，包括检测的部分，如Eq。在这种情况下，为了简单起见，代表fisetinidol的272.3单位被删除（因为它在图4的光谱中未检测到），并且阳离子化离子K ⁺（39.1）报告。变量 y 和 z 具有与等式3和 w 是单宁低聚物中没食子酸酯部分的数量 M + K ⁺ = y ?288.3 + z ?304.3 + > w ?152.1 + 39.1 + 2.0 （4）
  这种方程的应用如表5所示
  表5.图4中报道的MALDI-TOF光谱的解释
  
  每种单宁低聚物的聚合度（DP）由等式（5）定义：
  DP = x + y + z （5）
  在哪里，
  x ， y 和 z 具有与等式（3）在糖基或酯部分存在下，它们的数目不应在DP的计算中考虑，因为它们被认为是单体单元的整合部分，例如，黄烷醇葡糖苷，黄烷醇没食子酸酯Bianchi等人，2014; Bianchi等人，2015年）。
结束语
1. 在植物组织的热水提取物酸解后，MALDI-TOF质谱法与HPLC-UV的组合允许获得提取物中存在的缩合单宁结构上的各种指标。
2. 两种方法都提供主要单体单元的指示，因此提取物中存在的缩合单宁类别
3. HPLC-UV与硫解组合得到关于平均聚合度的信息，并且还可以区分具有不同立体化学的单体单元。其主要限制是在侧链（支化）的情况下降低硫解功效和在不同于儿茶素，没食子儿茶素或其差向异构体的单体单元之间的异丙基磺酸键的不可裂解性。
4. MALDI-TOF质谱法提供聚合度的信息，其中具有最高检测m/z比的峰显示所测量样品中缩合单宁的最大（观察）聚合度。此外，不同于单纯黄烷-3-醇的单体单元的存在也可以通过MALDI-TOF质谱来阐明。

食谱

溶血介质
500mg半胱胺盐酸盐HPLC级
0.2ml盐酸37％HPLC级
9.3ml甲醇HPLC级
硫解介质的制备：

在20ml玻璃烧瓶中的分析天平上称量500mg半胱胺盐酸盐
用校准的Eppendorf移液管加入9.3ml甲醇，摇动混合物，直到任何固体残留物完全溶解
用校准的Eppendorf移液管加入0.2ml浓HCl（37％），并在室温下将混合物（35kHz，250W）超声处理5分钟。
将制备的硫解介质储存在冰箱（3-8°C）中，避光和空气直至使用

HPLC流动相

溶液A：0.10％v/v三氟乙酸水溶液（约55ml /样品）
溶液B：0.08％v/v TFA的乙腈水混合物（ACN:水= 4:1，v/v）（约25ml /样品）

致谢

我们感谢瑞士国家研究计划"资源木材"（NRP66）为这项工作提供财政支持。该协议是从最初在Matthews等人中描述的程序开始开发的。（1997），Torres和Lozano（2001），Pasch等人。（2001）和Monagas等人。（2010）。

参考文献

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