材料和试剂

30号胰岛素注射器（BD，Ultra-Fine ^TM，目录号：328431）
15 ml管
70微米细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：22363548）
15 mm培养皿
5ml注射器（BD，Luer-Lok ^TM，目录号：309646）
96孔v型底板
表达红色荧光蛋白（LLC-RFP），B16F10绿色荧光蛋白（B16F10-GFP）或其他荧光标记的肿瘤细胞系的Lewis肺癌细胞（AntiCancer.com， http://www.anticancer.com/Fluorescent_protein_cell_lines_April_2010.pdf ）

同基因受体小鼠。 LLC和B16F10肿瘤的C57BL/6J小鼠（The Jackson Laboratory，目录号：000664）。

TrypLE（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12604013）

Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30013.02）

UltraPure TM 0.5M EDTA，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575020）}

红细胞（RBC）裂解缓冲液（10x）（BioLegend，目录号：420301）

Fc区（CD16/32）（BD，Pharmingen ^TM，目录号：553141）

荧光染料共轭抗体：
CD11b-FITC（BioLegend，目录号：101206）
CD115-APC（BioLegend，目录号：135510） Ly6C-APC-Cy7（BioLegend，目录号：128026） CD45-BV421（BioLegend，目录号：103134）

牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）

活/死可固定蓝（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：L34962）

叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）

流缓冲器（FB）（参见配方）

RBC裂解缓冲液（参见配方）

设备

细胞培养瓶
离心机
具有最佳激发和肿瘤荧光团（BD，LSRII或类似物）或Amnis成像细胞仪（ImageStream X Mark II）的多参数流式细胞仪

软件

ImageJ软件（ImageJ）
FlowJo软件（版本9.2）
Prism软件（GraphPad软件）

程序

肿瘤注射
1. 收集在细胞培养瓶中生长的约70-80％汇合的LLC-RFP肿瘤细胞。用DPBS洗涤两次，然后轻轻地胰蛋白酶消化细胞约3-5分钟。我们发现，当收集用于注射时，具有70-80％汇合且高度可行（> 95％）的肿瘤的最大量的再现性。
  注意：如果肿瘤细胞活力存在任何问题，在肿瘤收集后通过台盼蓝染色或其他方法检测活力。
2. 重悬细胞在DPBS中，并在300×g离心5分钟。重复DPBS清洗。
3. 用DPBS洗涤肿瘤细胞两次，然后轻轻地胰蛋白酶消化细胞。将细胞在DPBS中并在300×g离心5分钟。重复DPBS清洗。
4. 计数细胞并以3×10 6细胞/ml升高
5. 将悬浮在100μlDPBS中的表达红色荧光蛋白（LLC-RFP）或其它荧光标记的肿瘤细胞系的3×10 5个Lewis肺癌细胞静脉内（在尾静脉中）静脉内注射到尾静脉中30号注射器。受体小鼠应该对于肿瘤细胞系是同基因的（C57BL/6J小鼠对于LLC和B16F10肿瘤）。在静脉内注射肿瘤后4和72小时之间观察到循环骨髓细胞中肿瘤材料的最佳内化，但是在注射后可以在肺组织中观察到肿瘤材料观察者至少3周。
免疫细胞的分离
1. 将样品收集在装有DPBS（含2mM EDTA）的15ml管中
2. 收集200μl-1ml血液，整个脾脏或整个肺
3. 离心300×10 5分钟用于血液，然后用10ml RBC缓冲液裂解RBC 5分钟。
4. 放置一个70微米过滤器在15毫米培养皿和机械解离脾或肺通过过滤器使用5毫升注射器柱塞。将细胞溶液倒入15ml试管，然后用2ml RBC缓冲液裂解2-5分钟
5. 用10 ml DPBS洗涤1次，并离心300×g 10分钟（如果必要，重复裂解血液）。
6. 在流动缓冲液（FB）中重悬细胞约1×10 7个细胞/ml
免疫细胞染色
1. 在96孔v-底板中放置?2×10 6个细胞/孔
2. 洗涤细胞在200微升在FB，离心5分钟，在300×g ，弹出洗涤（摇摆板在水槽上以移除液体）。
3. 重悬细胞在100微升Fc块（CD16/32）稀释1:200（制作主混合，并使用多通道移液器加入细胞）。
4. 让我们坐在冰上5分钟。
5. 使荧光染料结合的抗体和活力染料的主混合物染色FB中感兴趣的免疫细胞群体。如果测定LLC-RFP摄取，避免其他红色通道（PE，PE-Cy7和Percp5.5），如果测定B16F10-GFP，避免绿色通道（FITC/A488/GFP）。例如，为了在LLC-RFP注射后标记骨髓细胞群体，我们使用CD11b-FITC，CD115-APC，Ly6C-APC-Cy7，CD45-BV421和活/死蓝，但是该面板可以根据感兴趣的细胞和肿瘤注射。
6. 在200μlFB中洗涤细胞，在300×g离心5分钟，轻轻吹洗。
7. 重悬细胞在100μl的荧光染料结合的抗体主混合物。
8. 用单一抗体染色补偿对照/珠子。
9. 在冰上孵育30分钟。
10. 用200μlFB洗涤细胞2次，以300×g离心5分钟，轻拂洗出。
11. 重悬于200μl的FB
12. 转移200微升到分析管，并在流式细胞仪或Amnis成像细胞仪上运行样品
13. 在活细胞上，然后在感兴趣的CD45 +免疫细胞群中，然后在免疫细胞群中发现的RFP ⁺或GFP ⁺肿瘤材料通过流式细胞术（图1）或使用成像细胞计数器的图像肿瘤材料定位（图2）。
  
  图1. LLC-RFP ⁺肿瘤材料在从血液分离的CD11b + sup/+骨髓细胞中的门控，并通过流式细胞术分析。活，CD45 ⁺免疫细胞
  
  图2.通过从血液分离的CD11b +髓样细胞（Orange）成像B16F10-GFP肿瘤材料摄取（绿色），并通过成像细胞计数分析。将细胞在活体上门控，CD45 ⁺免疫细胞。右下角的比例尺为10μm。

数据分析

对于我们的流式细胞术和成像细胞计数分析，我们通常用肿瘤材料或每个细胞中肿瘤材料的相对量或大小来量化细胞群的百分比。 CD45 +免疫细胞的百分比的计算基于通过正向和侧向散射和存活力分析确定的活细胞。可以使用ImageJ软件从成像细胞计数数据测量细胞中肿瘤材料的平均尺寸。用LSRII评估细胞荧光，并用FlowJo软件（版本9.2）分析。用Prism软件分析所有实验的数据。未配对的测试和双向方差分析用于实验组的比较。 P 值小于0.05被认为是显着的。数据似乎是正常分布的，在实验组之间和之内观察到类似的标准偏差和误差。

笔记

在收集和染色过程中始终保持免疫细胞在冰上
工作速度快，不要让样品在分析前停留太久，因为内化肿瘤材料可能迅速降解或失去荧光。在收集的3小时内分析样品以获得最佳结果。
在流式细胞仪上在通道检测肿瘤材料中设置检测器相当高，以便检测被细胞吞噬的肿瘤的小片段。虽然没有通用的范围设置这些检测器，因为细胞仪设置和荧光灯亮度变化，检测器设置应该将肿瘤材料在细胞仪流量图的上对数标度，而不会超出规模。
为了再现性，从可疑IV注射肿瘤的分析中除去任何小鼠，因为注射的肿瘤材料的量的变化性可极大地影响在免疫细胞中测量的肿瘤摄取量。

食谱

流缓冲器（FB）
10g 1.0％BSA 1g 0.1％叠氮化钠 1 L 1x DPBS
储存于4°C。
RBC裂解缓冲液
从库存稀释10倍

致谢

这项工作由NIH授予R01 HL118765和R01 CA202987（均为C.C.H.），美国心脏协会科学家发展授权125SDG12070005（授予R.N.H），La Jolla过敏和免疫学研究所董事会研究员（授予R.N.H）支持。

参考文献

Hanna，D。，Rasquinha，N.，McArdle，S.，Wu，R。，Peluso， E.，Metzger，D.，Ichinose，H.，Shaked，I.，Chodaczek，G.，Biswas，SK和Hedrick，CC（2015）。 Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung。 Science 350（6263）：985- 990。

Headley，MB，Bins，A.，Nip，A.，Roberts，EW，Looney，MR，Gerard，A.and Krummel，MF（2016）。对肺中先驱转移细胞的即时免疫应答的可视化。 531 ）：513-517。

Pucci，F。和Pittet，MJ（2013）。分子途径：肿瘤来源的微泡及其与免疫细胞在体内的相互作用。 Clin Cancer Res 19（10）：2598-2604。

Pucci，F.，Garris，C.，Lai，CP，Newton，A.，Pfirschke，C.，Engblom，C.，Alvarez，D.，Sprachman，M.，Evavold，C.，Magnuson， Andrian，UH，Glatz，K.，Breakefield，XO，Mempel，TR，Weissleder，R。和Pittet，MJ（2016）。 SCS巨噬细胞通过限制肿瘤衍生的囊泡-B细胞相互作用来抑制黑素瘤。 352（6282）：242 -246。

Vader，P.，Breakefield，XO and Wood，MJ（2014）。 Extracellular vesicles：emerging targets for cancer therapy。 Trends Mol Med 20（7）：385-393。