材料和试剂

细胞培养瓶
30号胰岛素注射器（BD，目录号：328431）Nr4a1-GFP（The Jackson Laboratory，目录号：018974），CX3CR1-GFP（The Jackson Laboratory，目录号：005582）或用于可视化免疫细胞的其它荧光报告小鼠。
1/2微盖玻??璃（12mm直径）（电子显微镜科学，目录号：72230-01）
PE-90管（BD，Intramedic ^TM，目录号：427420）
小鼠
表达红色荧光蛋白（LLC-RFP）或其他荧光标记的肿瘤细胞系（AntiCancer.com）的Lewis肺癌细胞
TrypLE TM超表达酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12604013）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（GE Healthcare，Hyclone ，目录号：SH30038.02）
盐酸氯胺酮
甲苯噻嗪盐酸盐
Vetbond胶（3M，目录号：1469SB）
氧气
乙醇
Dow Corning高真空润滑脂（Sigma-Aldrich，目录号：Z273554）

设备

离心机
机械鼠标呼吸机（Harvard Apparatus，型号：845）
精细解剖镊子和剪刀（精细科学工具）
成像用吸引环（Mekilect，目录号：吸引环）
带压力调节器和压力表的真空管道
立式共焦或2光子显微镜与共振扫描仪（我们使用徕卡SP5），加热舞台和长距离20-25x水浸物镜适合实时成像。

软件

Imaris软件（版本7.1.1 x 64）（Bitplane， http ：//www.bitplane.com/download/manuals/ReferenceManual6_1_0.pdf ）
Prism软件（GraphPad软件）

程序

肿瘤注射
1. 收集在细胞培养瓶中生长的约70-80％汇合的LLC-RFP肿瘤细胞。用DPBS洗涤两次，然后轻轻地胰蛋白酶消化细胞约3-5分钟。我们发现，当收集用于注射时，具有70-80％汇合和高度存活（> 95％）的肿瘤的最大量的再现性。
  注意：如果有任何肿瘤细胞活力的问题，在肿瘤细胞收集后通过台盼蓝染色或其他方法检测活力。
2. 重悬细胞在DPBS中，并在300×g离心5分钟。重复DPBS清洗。
3. 计数细胞并确认高活力（> 95％），然后以3×10 6个细胞/ml将细胞重悬在DPBS中。
4. 将悬浮在100μlDPBS中的表达红色荧光蛋白（LLC-RFP）或其它荧光标记的肿瘤细胞系的3×10 5个Lewis肺癌细胞静脉内（在尾静脉中）静脉内注射到尾静脉中30号注射器。
鼠标成像
1. 用90mg/kg氯胺酮盐酸盐和15mg/kg盐酸赛拉嗪的初始剂量在0.5ml PBS中腹膜内注射小鼠以麻醉小鼠。在图像采集期间保持麻醉，一半剂量皮下增强每45分钟长达3小时。
2. 放置在仰卧位置在加热的显微镜载物台上的小鼠，实现直肠温度37°C。
3. 一旦诱导了足够的麻醉（通过爪收缩测试），暴露气管并与周围结缔组织分离。
4. 在平行于软骨环的前气管中切开一个小开口，并将以45度角修剪的PE-90管插入气管朝向肺。用Vetbond胶固定管道并闭合气管周围的皮肤，并连接到机械呼吸机。应用8至10μl/g体重（室内空气或更高的氧气分数）的潮气量，呼吸频率约为每分钟120次呼吸。这是平均大小的成年小鼠（25-30g）的近似正常呼吸率。
5. 重新评估麻醉深度与爪压缩。
6. Dab小鼠轻轻用70％乙醇围绕左肋骨和去除皮肤暴露肋骨。
7. 轻轻地插入剪刀之间的两个最低的肋骨和切割0.5厘米的洞进入胸腔。
8. 用镊子拔出孔上方的第二个肋，然后移取大约300微升PBS进入孔，以帮助从胸腔左侧肺叶。
9. 继续用镊子向胸腔施加向上的压力，以保持肺远离肋骨，防止肺损伤，同时去除肋骨。小心地清除覆盖左肺叶的三个前肋的约1.5cm，如图1所示。
  
  图1.步骤B9中描述的肺左叶曝光图像
10. 在真空环的内边缘涂一薄层高真空润滑脂，然后将一个用高真空油脂密封的12 mm玻璃盖玻片贴在真空吸环上。使用连接到压力表和调节器的专用真空管线对环施加20至25mmHg的真空吸力以调节压力。
11. 小心地将胸部吸气窗降低到左肺叶的平坦表面，然后进入胸部窗口并稳定成像，如图2所示。
  
  图2.肺左叶吸气窗的图像
12. 添加?200微升DPBS到幻灯片，将显微镜透镜放在成像环上，如图3所示，并根据需要获取成像。通过成像确认肺中的正常血流量，以确保环没有造成血管损伤/阻塞。聚焦于通过真空环相当稳定的区域的成像，以防止由于肺的脉冲引起的图像的运动伪影和失真。代表性肺成像显示在视频1和视频2中
  
  图3.连接到活小鼠肺的肺吸气环上的显微镜透镜的图像
13. 成像后关闭真空，取下显微镜镜头和成像环，并安乐死鼠标。
  
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  视频1. Nur77-GFP高巡逻单核细胞（绿色），所有CD45-APC ⁺免疫细胞（蓝色）和LLC-RFP肿瘤（红色）在小鼠肺中的代表性实时成像。在成像前24小时，用LLC-RFP肿瘤IV注射Nur77-GFP小鼠。 IV注射CD45-APC。
  
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  视频2.使用Imaris的实时成像数据的代表性三维重建 Nur77-GFP ^高巡逻单核细胞（Green），GR1（Ly6G/C）-APC ^{中性粒细胞和经典单核细胞（蓝色）和LLC-RFP肿瘤（红色）。在成像之前7天，用LLC-RFP肿瘤IV注射Nur77-GFP小鼠。 IV注射GR1（Ly6G/C）-APC。}
  
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数据分析

使用Imaris软件（版本7.1.1 x 64）进行肺图像的三维重建和漂移校正。有关使用Imaris软件的详细说明，请访问： http://www.bitplane.com/download/manuals/ReferenceManual6_1_0.pdf。在内核大小为3 x 3像素的情况下，通过中值滤波平滑图像。当需要时，由使用ImageJ插件的刚体配准来校正由呼吸引起的运动伪像（McArdle等人，2014; McArdle等人，2015）。 Imaris软件还用于通过检测每个荧光通道中的细胞来自动处理3D视频数据，然后通过随时间链接所检测的细胞来创建轨迹（使用Imaris的"随时间变化的斑点"功能）。手动编辑轨道以提高精度。用Prism软件分析所有实验的数据。未配对的测试和双向方差分析用于实验组的比较。 P 值小于0.05被认为是显着的。数据似乎是正常分布的，在实验组之间和之内观察到类似的标准偏差和误差。

笔记

任选：静脉内注射（后眼）直接缀合的荧光抗体（20μg稀释至100μl，在DPBS中的Ly6G：嗜中性粒细胞，CD3e：T细胞，CD31：内皮细胞等）其他免疫细胞或脉管系统。抗体标记的最佳颜色将随着显微镜设置而变化，但是我们发现APC/A647，FITC/A488，BV421或PE标记抗体的良好成像。应在成像前或成像期间注射抗体。可以在体内检测细胞的良好抗体标记大约30分钟至大于3小时，并且根据抗体和荧光团缀合物显着变化。
该相同的方案和真空环可以应用于对其他器官（脾，肾，胰腺，皮肤，等）成像。对于除肺以外的器官，呼吸器不是必需的。

致谢

该协议改编自描述肺活体成像的早期方案（Thornton等人，2012）。这项工作由NIH授予R01 HL118765和R01 CA202987（均为C.C.H.），美国心脏协会科学家发展授权125SDG12070005（授予R.N.H），La Jolla过敏和免疫学研究所董事会研究员（授予R.N.H）支持。

参考文献

Hanna，D。，Rasquinha，N.，McArdle，S.，Wu，R。，Peluso， E.，Metzger，D.，Ichinose，H.，Shaked，I.，Chodaczek，G.，Biswas，SK和Hedrick，CC（2015）。 Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung。 Science 350（6263）：985- 990.
McArdle，S.，Chodaczek，G.，Ray，N.和Ley，K.（2015）。活体细胞触发的成像系统揭示了动脉粥样硬化动脉中的单核细胞巡逻和巨噬细胞迁移。生物选择 20（2）：26005。 />
McArdle，S.，Acton，ST，Ley，K.和Ray，N。（2014）。
Thornton，EE，Krummel，MF和Looney，MR（2012）。肺的实时成像。 12：