材料和试剂

10厘米培养皿
50 ml Beckel离心管
1.5 ml微量离心管
Amicon Ultra-15离心过滤器
0.45μmimmobilon-FL PVDF（EMD Millipore，目录号：IPFL00010）
野生型MEF和Rab8a ^-/- MEF细胞系
之前描述了MEF分离和表型分析（Das等人，2015）
DEME与葡萄糖，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠（Mediatech，目录号：10-013）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442-500ML）
Pen-strep（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140-122）
乳白蛋白水解产物溶液（50x）（Sigma-Aldrich，目录号：58901C-100ML）
NaN ₃
NaF
Na ₃ VO ₄
PMSF
DTT
Nonidet P40替代品（Sigma-Aldrich，目录号：74385-1L）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
Tween 20（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP337-500）
氯化钠（NaCl）
氯化钾（KCl）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
蛋白酶抑制剂混合物片剂（Sigma Aldrich，目录号：11873580001）
脱脂乳粉（EMD Millipore，目录号：1.15363.0500）
Amersham ECL Western印迹检测试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2209）
Amersham ECL兔IgG，HRP连接的整个Ab（来自驴）（GE Healthcare，目录号：NA934V-1ML）
Wnt5a/b（C27E8）兔mAB（Cell Signaling Technology，目录号：2530S）
组蛋白H3（D1H2）XP兔mAb（Cell Signaling Technology，目录号：4499S）
10％FBS DMEM（参见配方）
1x LAH DMEM（参见配方）
非变性裂解缓冲液（参见配方）
1％Tween 20的PBS（PBST）（见Recipes）
PBST中的5％脱脂牛奶（参见配方）
1x运行缓冲区（参见配方）
1x传输缓冲区（请参阅配方）

设备

Thermo IEC Centra CL3R台式，冷冻离心机
Avanti J-26 XP离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-26XP）
Beckman JA-25.50转子（Beckman Coulter，型号：JA-25.50）
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell（Bio-Rad Laboratories，型号：1658005EDU）
XCell SureLock Mini-Cell和XCell II印迹模块（Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM，目录号：EI0002）
QSonica XL-2000（Qsonica，型号：XL-2000）
Ultrospec 2100紫外 - 可见分光光度计（Biochrom，型号：80-2112-21）

程序

细胞培养/转染
1. 在DMEM + 10％FBS中培养野生型MEF和Rab8a -/- MEF细胞系，直到在10cm陪替氏培养皿中90-95％汇合。
2. 用补充有12ml1X乳清蛋白水解产物溶液（LAH）的DMEM替换DMEM + 10％FBS。
3. 监测细胞的形态在接下来的48小时。
4. 48小时后，将条件培养基收集在50ml离心管中并在4℃下以10,000×g离心10分钟。将上清液转移到干净的管中，并立即进行步骤B1最大产量。上清液可以在解冻后冷冻和使用，但通常不推荐使用。
5. 洗涤培养皿1毫升1×PBS。重复清洗。
6. 随后向培养皿中加入1ml 1x裂解缓冲液，在冰上平放15分钟
7. 保持培养皿在冰上，使用细胞刮刀收集细胞裂解液，并转移到1.5毫升微量离心管。
8. 超声处理细胞裂解液（每次不超过1或2秒，进行3个循环），然后在13,300×g，4℃离心10分钟。
9. 将上清液转移到干净的微量离心管中，在-80℃下保存
条件培养基离心
1. 取条件培养基并将其加入Amicon Ultra-15离心过滤器
2. 在室温下将过滤装置以4,000×g离心90分钟
3. 使用200μl移液器回收浓缩液。为了最大限度地恢复，立即收集浓缩物。大约收集180μl浓缩的培养基。
4. 将浓缩液保存在-80°C。等分试样可以保存冷冻最多一年。
Western印迹检测
1. 使用Bradford测定（Bio-Rad试剂方案）测量蛋白质浓缩物。使用裂解缓冲液作为空白用于蛋白质测量
2. 在1×LDS样品缓冲液中制备30μg总蛋白样品
3. 在80V下在10％SDS-PAGE凝胶中运行样品，并且当染料脱离凝胶时立即停止
4. 将蛋白转移到0.45μmPVDF膜上。设置转印设备，并在300 mA下运行90分钟。
5. 转移后，取PVDF膜并用PBST中的5％脱脂乳封闭。使膜在室温下在振荡器上阻断1小时
6. 随后，取膜并在4℃下在1:1000稀释的抗-mWnt5a/b抗体中孵育过夜。在PBST中的5％脱脂乳中稀释抗体
7. 在第一抗体孵育16小时后，在PBST中洗涤膜，并置于振荡器上10分钟。重复两次，共三次洗涤。
8. 与抗兔抗体在室温下1:2,000稀释孵育1小时。在PBST中的5％脱脂乳中稀释抗体
9. 在PBST中洗涤膜，并置于振荡器上10分钟。重复两次，共三次洗涤。
10. 应用ECL试剂到膜5分钟。
11. 继续曝光X光胶片30秒并显影。

代表数据

图1.在条件培养基中检测Wnt5a。来自Rab8a +/+和Rab8a -/- MEF的细胞裂解物和条件培养基用抗 - -mWnt5a一抗。组蛋白3用作对照以确定培养基样品中细胞裂解物的污染。

食谱

10％FBS DMEM
950ml具有4.5g/L葡萄糖，L-谷氨酰胺&丙酮酸钠 50ml胎牛血清
5ml pen-strep
1x LAH DMEM（50ml）
49ml具有4.5g/L葡萄糖的DMEM，L-谷氨酰胺&丙酮酸钠 1ml乳清蛋白水解产物溶液（50x）
非变性裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 10 mM EDTA
0.02％NaN 3
50mM NaF 1mM Na 3 VO 4 sub。
0.5％Np40替代品
1mM PMSF
0.5 mM DTT
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（1片，10mL）
0.1％Tween 20的PBS（PBST）（1L）中 1ml Tween ^? 20
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4 sub/
PBST中的5％脱脂牛奶
将5g脱脂奶粉溶于100ml PBST中
1x运行缓冲区
3.0275克Tris碱
14.4g甘氨酸
10g十二烷基硫酸钠溶解在最多1000毫升MilliQ水中。
1x传输缓冲区
14.4g甘氨酸
3.02克Tris碱
溶于700ml MilliQ水中
加入200ml甲醇，一旦完全溶解

致谢

这项工作由国家卫生研究院（NIH）授予[DK102934，DK085194，DK093809，CA178599]支持。 NG也得到美国癌症协会的研究学者资助[RSG-15-060-01-TBE]的支持。

参考文献

Das，S.，Yu，S.，Sakamori，R.，Vedula，P.，Feng，Q.，Flores，J.，Hoffman，A.，Fu，J.，Stypulkowski，E.，Rodriguez， Dobrowolski，R.，Harada，A.，Hsu，W.，Bonder，EM，Verzi，MP and Gao，N.（2015）。 Rab8a囊泡调节Wnt配体递送和Paneth细胞在肠干细胞巢的成熟发育 142 12）：2147-2162。