材料和试剂

细胞刮刀（Corning，Falcon ，目录号：353085）
150mm组织培养处理的皿（Corning，目录号：430599）
50ml离心管锥形管（Corning，目录号：430829）
15ml离心锥形管（Corning，目录号：430791）
1.5ml离心管
硝化纤维素膜（GE Healthcare，目录号：10600011）
SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞
穿刺箔
RPMI培养基（ATCC，目录号：30-2001）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10437-028）
遗传霉素（G 418二硫酸盐）（Sigma-Aldrich，目录号：A1720）
Fungizone（两性霉素B）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15290018）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140122）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340-1ml）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
含有以下试剂的细胞表面蛋白分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：89881）

磺基-NHS-SS-生物素
磷酸盐缓冲盐水（PBS）包装，在超纯水中重构
淬火溶液
Tris缓冲盐水（TBS）包装，在超纯水中重构
裂解缓冲液
固定化中性抗生素凝胶
洗涤缓冲液
栏和盖
无称重二硫苏糖醇（DTT）

超纯水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502）
SDS-PAGE样品缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：39001）的
样品缓冲液（Pierce
4-20％Tris-甘氨酸凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：EC60252BOX）
注意：此产品已停产。}
印迹级阻断剂（脱脂奶粉）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706404）
（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP337-100）的微生物生长培养基（Invitrogen）
山羊多克隆抗Y5R抗体（Everest Biotech，目录号：EB06769）
驴抗山羊抗体，辣根过氧化物酶缀合物（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2020）
SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：34080）

设备

离心15ml管（BD，Adams TM，型号：DYNAC TM supent TM离心机0101）
注意：设备已停产。可以用任何离心机更换15毫升管。
离心机用于Eppendorf管（Eppendorf，型号：Centrifuge 5417C）
注意：设备已停产。可以用任何装有1.5毫升管的离心机替换。
摇摆平台（Boekel Scientific，目录号：260350）
超声波仪（Thermo Fisher Scientific，型号：Sonic Dismembrator 550）
注意：设备已停产。可以由任何其他超声波仪更换。

程序

治疗
1. 将待测细胞置于150mm培养皿中，在第二天获得80-90％汇合（每次标记反应不超过4×10 7个细胞）。
  注意：在我们的研究中，我们使用稳定转染了TrkB受体的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞，所述细胞在补充有10％胎牛血清，0.3mg/ml遗传霉素，0.5μg/ml杀菌剂，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Ho等人，2002）。将细胞以2×10 6个细胞/板的密度铺板。
2. 第二天，将标准细胞培养基更换为不含血清的培养基（无血清培养基）。
3. 24小时后根据需要处理细胞注意：在我们的研究中，我们用浓度为10μM的NPY和1ng/ml的BDNF处理细胞8分钟（Czarnecka等人，2015）。未处理的细胞用作对照。
生物素化
1. 将含有12mg Sulfo-NHS-SS-生物素的1个小瓶中的内容物溶解在48ml冰冷的PBS中，使生物素标记溶液中的终浓度为0.25mg/ml生物素。
2. 在所需的处理后，除去培养基并用每个培养皿中冰冷的PBS洗涤细胞两次。清洗后立即取出PBS。
  注意：不要让PBS与细胞保持接触超过5秒钟，以防止细胞四舍五入和分离。
3. 向每个皿中加入12ml生物素标记溶液。
4. 将培养皿放在摇床或轨道摇床上，在4℃下轻轻搅动30分钟（细胞必须用生物素标记溶液覆盖）。
5. 向每个培养板中加入600μl淬灭溶液（保存并在4℃下使用）以淬灭反应。通过轻轻倾斜平板，确保均匀覆盖细胞，然后进行下一步
6. 轻轻刮细胞入溶液，并将内容物转移到相应的50ml锥形管。用单个4ml体积的冰冷的TBS冲洗每个板。将保留在冲洗液中的细胞加入到相应于适当处理组的50ml锥形管中的先前收集的细胞中
7. 在4℃下以500×g离心细胞3分钟。
8. 弃去上清液。
9. 加入5毫升冰冷的TBS，轻轻吹打重悬细胞
10. 在4℃下再次离心细胞3分钟
11. 弃去上清液。
细胞溶解
1. 用蛋白酶抑制剂混合物以1:100的比例补充所需量的裂解缓冲液（样品数量×370μl+体积过量10％）。
2. 通过吸移重新悬浮细胞在370微升的裂解缓冲液，然后转移到适合于超声处理的管（在我们的情况下15毫升管）。
3. 超声波（1.5功率）5 x 1秒爆发。
4. 在冰上孵育细胞30分钟，在此期间：
5. 将澄清的上清液转移到1.5ml离心管中。在这个阶段：
6. 将30μl的每种标准化裂解物置于凝胶上作为上样对照。使用剩余体积（约370μl）分离生物素化的细胞表面蛋白（下面的步骤D6）。
标记蛋白的分离
1. 将一列插入收集管。
2. 向每个柱中加入350μlNeutrAvidin琼脂糖凝胶，并盖上柱子
3. 以1,000 x g离心1分钟，然后丢弃流通（FT）。
4. 向凝胶中加入400μl洗涤缓冲液。
5. 以1,000 x g离心1分钟，然后丢弃FT
6. 将底盖应用于每个柱，并将细胞裂解物添加到琼脂糖;将顶盖应用于每列（将每个盖包裹在石蜡膜中，如图1所示）
  
  图1.单个包含封口膜（蓝色）的底部和顶盖（红色）的柱状图
7. 在室温下孵育60分钟，通过将柱置于旋转器/摇摆平台上进行混合
8. 将蛋白酶抑制剂混合物加入到根据下式计算的所需量的洗涤缓冲液中：样品数×4个洗涤步骤×400μl+超过10％体积。
9. 取下底盖，将色谱柱放入收集管中。
10. 以1,000 x g离心柱1分钟，然后丢弃FT
11. 将柱子放回收集管中，取出顶盖，并向每个柱中加入400μl洗涤缓冲液
12. 将两个大写字母应用到列，并通过反转列来混合内容。
  注意：为了简化此步骤，可以保留一块石蜡膜（需要在每个步骤中为每个样品使用一个新的碎片）代替底盖。
13. 取下底盖，以1,000 x g离心1分钟，然后弃掉FT。
14. 取下顶盖。
15. 重复步骤D11-D14三次。
16. 替换列上的底盖。
蛋白洗脱
1. 用移液管吸头覆盖一个无称重DTT微量管的穿刺箔，并加入50μl超纯水以获得1M DTT。
2. 通过将所需体积的SDS-PAGE样品缓冲液（样品数×150μl+体积过量10％）与1M DTT溶液以1:20的比例混合，得到终浓度为50mM的DTT，制备上样缓冲液。
3. 向每个柱中加入150μl含有DTT的SDS-PAGE样品缓冲液（树脂必须被覆盖），然后从顶部和底部加入帽柱。
4. 在摇动平台上在室温下孵育柱子60分钟。
  注意：或者，如试剂盒中提供的原始方案中所述，可以在加热块中在95℃加热样品5分钟。然而，它将导致洗脱液中一些NeutrAvidin蛋白单体（15kDa）的回收。
5. 先卸下色谱柱的顶盖，然后是底盖;将柱放置在新的收集管中并应用顶盖注意：在高温洗脱的情况下（上述步骤E4），去除盖子的顺序特别重要，因为它可以防止洗脱液从试管中泄漏。
6. 以1,000 x g离心2分钟。
7. 通过Western印迹分析洗脱液和输入样品（见下文）。如果不立即使用，请将样品储存在-20°C
蛋白质分离和通过蛋白质印迹的目标蛋白质鉴定
1. 通过在沸水中孵育2分钟使变性洗脱液变性。
  注意：洗脱液已经在SDS-PAGE样品缓冲液中，用于从柱中洗脱生物素化的蛋白质，如蛋白质洗脱部分中所述。 >
2. 此外，如上面第1点所述，通过加入具有还原剂（50mM DTT）的SDS-PAGE上样缓冲液和变性样品，制备先前获得的裂解物用于Western印迹。
3. 在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上分离两种级分（即洗脱液和裂解液），根据标准方法转移到硝酸纤维素膜上。
4. 用含有0.2％Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）中的5％牛奶封闭硝酸纤维素膜
5. 用期望的初级和二级抗体进行印迹以检测感兴趣的表面受体。
  注意：在我们的研究中，我们使用在5％牛奶/TBST中以1:1,000稀释的山羊多克隆抗Y5R抗体，随后是以1:25,000稀释的驴抗山羊 - 辣根过氧化物酶连接的抗体。
6. 用SuperSignal West Pico化学发光底物开发免疫印迹。任选地，如果预期有弱信号，则可以使用更敏感的Femto化学发光底物

数据分析

在细胞表面蛋白提取的过程中，将细胞暴露于膜不可渗透的生物素化试剂。随后，裂解细胞，并且交联的膜蛋白在具有抗生物素蛋白树脂的柱上亲和纯化。基于通过蛋白质印迹分析的洗脱液中缺少代表性细胞内蛋白质（热休克蛋白90，Hsp90;钙联蛋白），制造商验证试剂盒功能。我们的实验证实了这一观察。尽管细胞外膜蛋白（例如Y5R）在裂解物和洗脱物级分中容易检测到，但是洗脱物在细胞内蛋白质例如细胞质p42/44有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和线粒体标记物，细胞凋亡诱导因子（AIF）（图2）。值得注意的是，根据我们的方案，与裂解物相比，洗脱液的体积为5倍

图2.细胞表面蛋白制备物耗尽细胞内蛋白质。在原始裂解物和含有细胞表面蛋白的洗脱液中容易检测到细胞膜蛋白Y5受体（Y5R），而后者部分缺乏细胞质p42/44丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和线粒体凋亡诱导因子（AIF）。装载在凝胶上的蛋白质分别对应于裂解物和洗脱物级分的原始裂解物体积的0.04和0.2，表明洗脱物级分浓缩5倍。

我们使用上述程序提供NPY受体Y5R和BDNF受体TrkB之间的串扰的证据。为此，用NPY或BDNF处理用TrkB受体稳定转染的SHSY5Y神经母细胞瘤细胞8分钟（Czarnecka等人，2015; Ho等人，2002）。基于先前的延时显微镜实验来选择刺激和配体浓度的时间（Czarnecka等人，2015）。在配体处理后，表面蛋白被标记，免疫沉淀并通过蛋白质印迹分析Y5R。如图3所示，NPY刺激导致Y5R的表面分数的适度降低，而BDNF处理触发更显着的Y5R内化。这些数据与并行实验的结果一致，其中通过延时显微镜检查受体内化（Czarnecka等人，2015）。

图3.表面蛋白质免疫沉淀实验的代表性结果 A.Y5受体（Y5R）在SY5Y/TrkB转染子中的细胞膜表达。在控制条件下，Y5R存在于细胞膜上，加入NPY以及BDNF降低Y5R的细胞膜库。 B.总Y5R水平在细胞裂解物中没有差异，证实了相等的蛋白质输入。

致谢

这项工作得到国家卫生研究院（NIH）资助：1RO1CA123211，1R03CA178809，R01CA197964和J21CA198698支持。该协议改编自Czarnecka等人。（2015）。

参考文献

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Czarnecka，M.，Trinh，E.，Lu，C.，Kuan-Celarier，A.，Galli，S.，Hong，SH，Tilan，JU，Talisman，N.，Izycka-Swieszewska，E.，Tsuei，J （a），（a），（b），（c），（c），（c）和（c） "href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25132261"target ="_ blank">神经肽Y受体Y5作为神经母细胞瘤中的诱导性前生存因子：对肿瘤化疗耐药性的影响。 > Oncogene 34（24）：3131-3143。

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