材料和试剂

（容量：50ml）（Sigma-Aldrich，目录号：CLS9950250-72EA）的一次性玻璃锥形离心管中加入
带有标记点（?13mm）（带特氟龙衬垫帽的KIMAX试管）（Thomas Scientic，目录号：9210J23）的一次性螺纹培养管
巴斯德移液管（非堵塞，L 5/4英寸）（Sigma-Aldrich，目录号：S6018）
聚碳酸酯膜（Avanti Polar Lipids）
注意：它们的孔的直径由操纵器定义（例如：100nm，Avanti Polar Lipids，目录号：610005）。
用于透射电子显微镜（网格尺寸400目×62μm间距，铜）的栅格（Sigma Aldrich，目录号：G5026）
（Beckman Coulter;目录号：344090）和分流适配器（Beckman Coulter;目录号：356860）的0.80ml开放超清离心管（尺寸5×41mm）
用于蛋白质转移的硝化纤维素膜，例如：硝酸纤维素膜，0.2μm，8×12cm（Thermo Fisher Scientific，目录号：77012）
HeLa细胞（ATTC，目录号：CCL-2）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：41966-029/052）
胎牛血清（FBS）（Eurobio，目录号：CVFSVF0001）
青霉素/链霉素（PAN-Biotech，目录号：P06-07100）
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030-024）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190-094/069）}
氯仿（HPLC，≥99.8％，亚苯基稳定）（Sigma-Aldrich，目录号：34854）
甲醇（对于HPLC，≥99.9％）（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
水无菌过滤（BioReagent，适用于细胞培养）（Sigma-Aldrich，目录号：W3500）
C21：0脂肪酸（二十一烷酸）（Matreya，目录号：1241）
己烷（无水，95％）（Sigma-Aldrich，目录号：296090）
硫酸（99.999％）（Sigma-Aldrich，目录号：339741）
HEPES游离酸[N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）; 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸]]（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钠（NaCl）（ACS试剂，≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
液体N <2>
乙酸乙酯（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400）
蔗糖（≥99.5％）[α-D-吡喃葡萄糖基，β-D-呋喃果糖苷，D（+） - 蔗糖]（Sigma-Aldrich，目录号：S8501）
碘（ACS试剂，≥99.8％，固体）（Sigma-Aldrich，目录号：207772）
完成DMEM培养基（参见配方）
蛋白质 - 脂质结合缓冲液（参见配方）

设备

烧瓶（150cm ²）（Dominique Dutscher，目录号：190150）
37℃/5％CO 2细胞培养箱（Dominique Dutscher，目录号：911378M）中。
制冷台式离心机（Dominique Dutscher，目录号：472456）
通风橱（任何实验室的标准设备）
Vortex（Dominique Dutscher，目录号：079030）
瓶氮气
冷冻器（-20℃）（Dominique Dutscher，目录号：099288B）
10μl正位移移液管如microman gilson模型M10（Gilson，目录号：F148501）
烤箱（干热：100℃）（Dominique Dutscher，目录号：780405）
BPX70气相色谱柱（30m×0.25mm ID BPX700.25μm）（Trajan Scientific，目录号：054622）
气相色谱仪（Shimadzu，ref GC-2010 Plus High-end GC）
水浴（37℃）（Dominique Dutscher，目录号：910648）
带有夹持器/加热块的挤出机组（Avanti Polar Lipids，目录号：610000）
2×250μlHamilton注射器，1800系列（1825N，体积250μl，针头尺寸22s ga [斜角尖端]，针头L51mm [2英寸] ）（Sigma-Aldrich，目录号：21394）
冰箱（4℃）（Dominique Dutscher，目录号：670251B）
旋转搅拌器（Dominique Dutscher，目录号：062646）
碳蒸发器（Q150T Turbo-Pumped溅射涂布机/碳涂布机）（Quorum Technologies，型号：Q150T）
电子透射显微镜如JEOL-1400 plus（MET 120kV）（JEOL，型号：1400 Plus）
装备有MLS-50摆动转子转子（Beckman Coulter，目录号：367280）的超速离心机型TL100实验室顶部。
12％Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶（10孔，30μl）（Bio-Rad Laboratories，目录号：4561043）
电源供应商（Dominique Dutscher，目录号：049192）
SDS-PAGE装置（SDS-PAGE），例如用于微型预制凝胶的Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳槽，2-凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658005） >
蛋白转移装置，例如Trans-Blot TM Turbo TM sup/TM转移系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704150）
薄层色谱板：TLC铝箔上的硅胶（硅胶基质，L×W = 20×20cm）（Sigma-Aldrich，目录号：60805）
密封玻璃罐如Aldrich（R）矩形TLC显影罐（L×H×W = 27.0×26.5×7.0cm）（Sigma-Aldrich，目录号：Z126195）

程序

根据来自Bligh和Dyer（1959）的方案从HeLa细胞中提取总脂质，
1. 在完全DMEM培养基中用HeLa细胞平板培养150cm 2培养瓶，并在37℃，CO 2（高达100％汇合）存在下孵育3天）。
2. 用20ml DPBS冲洗单层。
3. 刮去DPBS中的HeLa细胞，并将它们在50ml玻璃管（PYREX 一次性玻璃锥形离心管，无帽）中的50ml DPBS中汇集。
4. 离心细胞10分钟，在4℃，350×g ，并除去上清液。
5. 在通风橱中，在室温下将细胞沉淀重悬在3ml氯仿/甲醇（1:2）中。
6. 在通风橱中，每5分钟涡旋细胞裂解液30分钟以溶解脂质（室温）。
7. 在通风橱中，加入500μl氯仿和900μlH 2 O，涡旋。
8. 在室温下以1,300×g离心10分钟。
9. 在通风橱中，将底部有机相转移到新的玻璃管管（带有标记点的一次性螺纹培养管，?13mm）（图1）。
  
  图1.显示上层水相与下层有机相分离的管的照片
10. 在通风橱中，用500μl氯仿和900μlH 2 O O重复提取（步骤A7-A9）以提高脂质纯度。
11. 在通风橱中，将底部有机相（每管1.5ml）等分到5ml玻璃管（一次性螺纹培养管）中。
12. 在通风橱中，在N 2流量（0.5至1psi）下蒸发溶剂。
  注意：该蒸发步骤还消除O 2分子，其将氧化磷脂的脂肪酸。
13. 保持干脂质膜（?200微克/管）在-20℃，直到使用注意：在甲醇分解后，通过气相色谱法进行甘油磷脂的定量（参见下一部分）。
甲醇分解后用气相色谱法定量提取的甘油磷脂
1. 为了从甘油骨架中分离脂肪酸并将其甲基化，将脂质膜（例如在部分A的末端获得的脂质膜）重悬浮在3ml的2.5％H 2 SO 4中， 4（在甲醇中）。通过移液器重悬几次。此步骤必须在通风橱下进行。
2. 加入分散在甲醇中的特定脂肪酸作为内标，例如1nmol（这应该代表小体积：通常为1或2μl）的C21：0。
3. 用聚四氟乙烯盖密封管子。
4. 脂肪酸的甲基化在100℃下在烘箱中进行1小时
5. 当管已经冷却（在室温：这只需要几分钟），通过加入3ml H 2 O停止反应，并通过吸移混合几次（在通风橱中）。
6. 通过加入3ml己烷：混合物，通过涡旋，在室温下在1,300×g离心10分钟，形成相，使用巴斯德吸管，将含有甲基化脂肪酸的上层相转移到玻璃管（一次性螺纹培养管）。此步骤必须在通风橱下进行。
7. 对含水底部相重复己烷萃取（步骤B6），并将第二上部有机相与第一个上部有机相合并。此步骤必须在通风橱下进行。
8. 在N 2物流（0.5-1psi）下干燥含有脂肪酸甲酯的合并的己烷相。此步骤必须在通风橱下进行。
9. 将脂质膜重悬于10μl己烷（通风橱）中，注入BPX70气相色谱柱（SGE）中，并使用火焰离子化检测器（Perkin Elmer）通过气相色谱法分析。使用的温度程序为：1）在130℃下7分30秒，然后2）温度从130℃至180℃的递增斜坡，以每分钟3℃的速率增加，最后在180℃下增加10分钟C。根据其大小和溶解度，通过N 2流动相（3.5ml/min）分离脂肪酸。通过将它们的保留时间与在甲醇分解步骤期间加入的C21：0内标脂肪酸的保留时间进行比较来量化它们。
  注意：150cm 2的合并的HeLa细胞烧瓶产生约400-420μg的甘油磷脂。
通过挤出形成大单层囊泡（LUV）
1. 在室温下在10mM HEPES-150mM NaCl（pH 7.4）中将脂质膜再水合过夜注意：脂质自然地组织成各种直径的MLV。
2. 为了获得具有限定直径（例如：100nm）的大单层囊泡（LUV）群体，溶液是：
  1. 冷冻在液氮中。
  2. 旋涡。
  3. 在37℃水浴中解冻。
    注意：重复3次的步骤C2a-C2c开始分离脂质层。
  4. 通过挤出机：强制20倍MLV通过维持在两个Hamilton注射器之间的聚碳酸酯膜的校准孔，使脂质双层彼此分离，并允许形成LUV。装配有两个Hamilton注射器的小型挤出机的照片可以在以下网站上看到： https://avantilipids.com/divisions/equipment/mini-extruder-extrusion-technique/。
    注意：LUV溶液必须保持在4°C，并在2天内用于实验
蛋白质 - 脂质结合测定
1. 结合测定在室温下在温和搅拌（旋转搅拌器）下进行30分钟：将6μg纯化（重组）蛋白与由150μg提取的脂质形成的LUV一起温育，并在100nm下挤出。
通过TEM分析孵育产物
1. 用铅笔刀雕刻碳棒（直径3.05mm）。
2. 碳棒放置在碳蒸发器的两个电极之间，云母片位于蒸发器室的中心。
3. 一旦达到室中的真空，碳蒸发400毫秒
4. 将2μl培养产物吸附在已预先蒸发在云母片上的碳膜的清洁侧上。
5. 通过将碳膜漂浮在含有100-150μl阴性染色溶液（2％醋酸铀酰溶液）的陶瓷孔（最大体积：200μl）中（图2），使碳膜与云母分离。
  
  图2.关于如何将碳膜漂浮到含有负染色溶液的孔中的照片
6. 使用小方形报纸（图3）将碳膜拾取到400目铜网上并空气干燥
  
  图3.照片说明了碳膜覆盖的铜网格如何与用于从井中捕获电网的报纸分离
7. 使用透射电子显微镜（TEM）例如在100kV下操作的JEOL-1400 Plus（MET 120kV）观察栅格。图像以10,000x或40,000x的标称放大倍数记录（参见"代表数据"部分）
通过不连续蔗糖梯度浮选分析孵育产物
1. 将蛋白质 - 脂质孵育产物与160μl40％蔗糖溶液混合并沉积在750μl开放管的底部。
2. 使用P200微量吸移管，将底部馏分逐步用110μl级份的以下蔗糖溶液：30％，20％，10％，5％，0％覆盖。注意：蔗糖溶液是在结合缓冲液中制备的。
3. 在使用TL100超速离心机的MLS-50摆动转子中，将梯度超离心16小时，在100,000×g，4℃。不连续蔗糖梯度的照片（虽然用于其它目的）可以在Bio-Protocol"Isolation of Growth Cones from Mouse Brain"（ http://www.bio-protocol.org/e853 ，图2，左图）。
4. 从顶部收集蔗糖级分并通过
  分析
  1. 免疫印迹检测研究的蛋白质（见下文G部分）
  2. Iodin熏蒸显示甘油磷脂（见下面H部分）
通过免疫印迹分析蛋白质
1. 将25μl每个蔗糖级分（或40μl底部蔗糖级分）与5μl加载染料溶液混合，并加载到SDS-PAGE（聚丙烯酰胺的百分比，以调节到所研究蛋白质的分子量，通常为12％凝胶允许分辨15-250kDa范围内的蛋白质（参见< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/LSR /文学/Bulletin_6040.pdf"目标="_blank"> http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf 并BioProtocol [BIO 101] <一个class ="ke-insertfile"href ="http://www.bio-protocol.org/e80"target ="_ blank"> Laemmli-SDS-PAGE ）。
2. 将通过SDS-PAGE分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并使用特异性抗体（通过化学发光显示的标准免疫印迹技术（ECL））进一步显示（图4A，下图）。
通过碘熏蒸引起甘油磷脂的显示
1. 将5μl每种蔗糖部分点样到薄层色谱板上：使用铅笔画一条线，并在线上彼此分开1cm。
2. 该板被引入到一个罐（例如一个槽的照片可以在<类="KE-的insertFile"可见HREF ="http://images.google.fr/imgres?imgurl=http%3A%2F ％2Fwww.capitolscientific.com％2Fcore％2Fmedia％2Fmedia.nl％253Fid％253D96999％2526c％253D1250437％2526h％253Dbd0e36b51d03d1012532&imgrefurl =的http％3A％2F％2Fwww.capitolscientific.com％2FKONTES-416180-1020-长方矮个子薄-LAYER色谱 - 开发 - 坦克与盖为-10-X&H = 255&W = 255&tbnid = 2rkzc5Pia_YQ3M％3A和文档ID = 2HrttSP8M4QktM&EI = lHNyV4WcKsiQaJmVk_AL与TBM = isch与客户端= firefox的-b-AB&IACT = RC&uact = 3&DUR = 310页= 1&启动= 0&ndsp = 12&VED = 0ahUKEwiFtv6g4srNAhVICBoKHZnKBL4QMwggKAEwAQ&波黑= 481&BIW = 1089"目标="_空白">网站）在iodin烟雾（iodin引入引入板进入槽）之前的槽30分钟的晶体饱和：iodin结合的双键脂肪酸，因此允许揭示存在于每个级分中的甘油磷脂（图4A，上图）。

代表数据

图4.通常用于分析脂质体和蛋白质的孵育产物的两种技术的图示。A.蛋白质rGRA2与在100nm下挤出的HeLa LUV的孵育产物的分析。将蛋白质与脂质：蛋白质比例为25：1的HeLa LUV孵育。将结合混合物与80％蔗糖混合，装载在管的底部，用步骤蔗糖梯度40％-0％（从底部到顶部）覆盖，并超速离心。将5微升每种级分点在硝酸纤维素上，通过用碘熏蒸显示不饱和磷脂（上图）。通过用抗GRA2 mAb（下图）探测的蛋白质印迹（WB）分析等体积的各级分。 B.蛋白质rGRA2和rGRA6与在100nm下挤出的HeLa LUV（脂质：蛋白质，50：1; rGRA2：rGRA6，10：1）共孵育的TEM分析。右图像表示白框中的区域的放大视图。这些图来自Lopez等人的图2。（2015）。

数据分析

结果取决于LUV的脂质中的组成和与它们孵育的蛋白质的性质。结合实验以及浮选实验/免疫印迹分析和TEM观察应该重复三次，具有类似的结果，以保证结果的重现性。结果主要是定性的。蛋白的相对量势必LUV膜和这因此漂浮到蔗糖梯度的顶部馏分可能使用磷光技术或通过使用ImageJ的程序（用于图像自由软件扫描ECL膜的信号象素的量化进行量化Java中的处理和分析; https://imagej.nih.gov/ij/）。使用的过程是"凝胶分析器"方法，作为"分析"菜单的子菜单（教程和示例： https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html ）。这种定量的实例可以在Lopez等人的中找到。（2015）。

食谱

完成DMEM培养基
10％（v/v）FBS
0.5％（v/v）青霉素/链霉素 2mM谷氨酰胺
蛋白质 - 脂质结合缓冲液
10mM HEPES（pH7.4） 150mM NaCl

致谢

该协议改编自：Lopez等人。（2015）。这项工作得到了第10组传染病罗讷 - 阿尔卑斯地区（C. Mercier）的资助。来自罗纳 - 阿尔卑斯地区的博士研究生（A.B.）。作者感谢EricMaréchal博士在甲醇分解后通过gaz色谱法定量提取的甘油磷脂; Dr Pauline Ruffiot为LUV形成的初步实验，前硕士学生安妮Valat，Khadi Sall，Fran?oisHermetet和Vincent Grassot他们参与项目。没有冲突或竞争的利益。

参考文献

Bligh，EG和Dyer，WJ（1959）。 A快速的总脂质提取和纯化方法。 Can J Biochem Physiol 37（8）：911-917。
Lopez，J.，Bittame，A.，Massera，C.，Vasseur，V.，Effantin，G.，Valat，A.，Buaillon，C.，Allart，S.，Fox，BA，Rommereim，LM，Bzik， DJ，Schoehn，G.，Weissenhorn，W.，Dubremetz，JF，Gagnon，J.，Mercier，C.，Cesbron-Delauw，MF和Blanchard，N。（2015）。血管内膜调节膜结合的弓形虫保护性抗原的CD8T细胞识别。 Cell Rep 13（10）：2273-2286。