材料和试剂

50ml锥形管（MIDSCI，目录号：C50B）
2ml微量离心管（MIDSCI，目录号：AVX-T-20-C）
拟南芥花序组织
液氮
纯乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：320110）
1N NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
3,4,5-三甲氧基肉桂酸（Sigma-Aldrich，目录号：T70408）
HCl（浓盐酸）（36-38％）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
乙酸乙酯（Sigma-Aldrich，目录号：270989）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：271004）
0.1％甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：94318）
- 富马酸（Sigma-Aldrich，目录号：C9008）
阿魏酸（Sigma-Aldrich，目录号：128708）
50％甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）

设备

砂浆和杵
塑料勺（适合小容量处理）
摇匀培养箱，37°C
用可容纳50ml锥形管并可达到10,000×g 的转子离心机
微量离心机
涡流
干燥炉，70°C
水浴，65℃
化学勺（适用于处理小体积）
微量移液器和提示（Mettler-Toledo，目录号：L-STARTXLS +）
重复移液器与分配用适配器注射器200μl（Mettler-Toledo，型号：AR-E1）
速度飞越
分析天平
具有UV检测器和自动进样器的HPLC系统（Shimadzu prominence modular HPLC：系统控制器CBM-20A，溶剂输送单元LC-20A，自动进样器SIL-20A，柱温箱CTO-20A，UV-VIS检测器SPD-20A） >
HPLC玻璃小瓶（VWR，目录号：89220-128）
Shim-pack XR-ODS柱（柱尺寸3.0×75mm，珠尺寸2.2μm）（Shimadzu，型号：Shim-pack XR-ODS）

程序

来自三个独立生物群体的三份样品应首先洗涤以除去可溶性代谢物。将约1g新鲜的拟南芥花序组织，剥离的叶和种子用于Anderson等人所述的分析。（2015）;然而，该方法可用于分析所有植物组织。简而言之，该过程包括：

使用研钵和杵将组织在液氮中研磨成粉末形式
使用塑料勺将地面组织转移到50 ml锥形管，根据所使用的组织量，可能需要更大体积的容器。如果允许组织解冻，组织的转移变得更加麻烦。建议立即转移组织。
使用40毫升80％乙醇洗涤研磨的组织，允许混合物在65°C孵育1小时，通过每15分钟涡旋充分混合。 1小时后，将混合物在10,000×g离心10分钟。倾析上清液，小心不要打扰沉淀的组织。
重复洗涤，在1小时的间隔，4至6次，直到溶剂清除（请参见图1）。
注意：其他植物组织，如叶或根，可能需要更少或更多的洗涤。
用20毫升丙酮洗一次。不要在65°C孵育。通过涡旋充分混合，然后在10,000×g下直接离心10分钟。倾析上清液小心不要打扰沉淀的组织。
置于干燥炉（70℃）中直至干燥。对于所述样品，充分干燥过夜。更多的组织将增加干燥时间。适当的干燥对于储存和处理是重要的。该洗涤步骤先前已在Meyer等人中公布。（1998）。

使用化学勺加入20毫克干燥，洗涤的细胞壁组织到2ml微量离心管中
加入600μl的1N NaOH，含有终浓度为50μM的3,4,5-三甲氧基肉桂酸作为内标，并在37℃下恒定搅拌孵育24小时。
使用重复移液器通过使用200μl浓HCl酸化溶液。最终的溶液应该是酸性的，以便将羟基肉桂酸适当地萃取到乙酸乙酯中
通过涡旋混合样品，并以14,000×g离心20分钟。
小心地将500μl上清液转移到新试管中，并加入1ml乙酸乙酯
通过涡旋混合样品，并以14,000×g离心5分钟
转移900微升的有机相到一个新的管，干燥完成使用速度Vac。
将干燥的提取物再溶解于50％MeOH中，并通过HPLC分析。在Shim-pack XR-ODS柱上分离提取物，使用在0.1％甲酸中从2.0％至25％的渐增29.5分钟的乙腈梯度，流速为0.9ml min -1 -1图2）。
定量样品中的p - 香豆酸和阿魏酸含量。使用相同的用于通过保留时间鉴定化合物的方法，分别运行真实标准（购买的p - 富马酸和其纯化形式的阿魏酸）。使用已知浓度的这些化合物的标准曲线来产生比较峰面积与浓度的线性公式。然后将该配方用于定量样品中化合物的浓度。应选择标准曲线的浓度，以使它们与样品中存在的化合物的量相似。这些化合物的峰面积应调整到内标的峰面积，以计及转移和移液误差。

代表数据

图1.来自洗涤组织的提取物的代表性取样。显示在洗涤过程中溶剂中存在的颜色减少的进程。左侧的管示出了在第一洗涤步骤之后溶剂可能看起来像什么。中间的管显示在第三次洗涤步骤后溶剂可能看起来像，右侧的管显示五次洗涤后可能看起来像什么，它准备用丙酮最后洗涤。

图2.来自拟南芥样品在330nm处的代表性色谱图。对应于p - 香豆酸，阿魏酸和3,4 ，5-三甲氧基肉桂酸已在该色谱图上鉴定;然而，真正的标准应该总是单独运行峰识别。

致谢

此协议最初是从Meyer 修改的。（1998），并且在Anderson等人中公开。（2015）。

参考文献

Anderson，NA，Bonawitz，ND，Nyffeler，K.和Chapple，C。（2015）。 FERULATE 5-羟化酶的缺失导致拟南芥中可溶性苯丙素类生物合成的介体依赖性抑制。植物生理学169 3）：1557-1567

Meyer，K.，Shirley，AM，Cusumano，JC，Bell-Lelong，DA和Chapple，C。（1998）。