材料和试剂

Underpad（AMG Medical，目录号：760-372）
21 G×1/2英寸针（BD，目录号：305167）
5ml注射器（BD，目录号：309646）
1.5ml微量离心管（Diamed，目录号：DIATEC610-3169）
1000μl移液管吸头（Diamed，目录号：DIATEC520-6753）
Kimwipes（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：06-666A）
1大鼠（ Rattus rattus; 100-300g）
异氟烷（CDMV，目录号：19417）
100％氧
290mOsm/kg对照溶液（Clinitrol TM sup/290参考溶液）（Advanced Instruments，目录号：3MA029）

设备

镊子（Dumont＃7b镊子）（Fine Science Tools，目录号：11270-20）
兽用气体麻醉机（Dispomed，型号：975-3300-000MRI）
感应室（VetEquip，型号：941444）
1000μl移液管（Gilson，Pipetman ^TM，型号：F123602）
Nosecone连接到Bain电路（VetEquip，型号：921463）
离心机（Spectrafuge 24D）（Labnet International，型号：C2400）
涡旋（Vortex Genie 2）（Scientific Industries，型号：SI-0236）
凝固点渗透压计（Advanced Instruments，型号：3320 Micro-Osmometer）
Ease-Eject 20-Microliter sampler（Advanced Instruments，型号：3M0825）
采样柱塞丝（Advanced Instruments，目录号：3M0828）
取样器吸头和室内清洁器??（Advanced Instruments，型号：3MA800）

程序

心脏穿刺
本节介绍准备测量血清渗透压浓度时采集和处理血液样本的心脏穿刺方法（参见注释A1）。
1. 深层麻醉将需要大约10分钟。将大鼠放入诱导室。将氧气流速调节至1.5-2L/min，将异氟烷蒸发器调节至5％。
2. 一旦大鼠已经停止移动几分钟（2-4分钟），它可以转移到工作表面上并且放置在附接到Bain回路的面罩上。
3. 将大鼠平行于自己在仰卧位置，头朝向你的非优势手，并尾部对你的优势手。将氧气流速调节至0.4-0.8 L/min，并在3-5％异氟烷下继续
4. 使用镊子夹住脚趾，确认其深度麻醉。大鼠不应作出反应。保持异氟烷3-5％（见注A2）。
5. 测试5毫升管上的柱塞，确保它平稳地移动。使柱塞略微缩回。安装21 G 1?英寸针。
6. 使用非惯用手，轻轻地将前肢向下压在桌子上，并向内进入身体，使爪子朝向它的后腿，前肢平??行于胸部。这种"挤压"前肢进入身体将抬起肋骨，提供更容易接近心脏
7. 用优势手，将针头以30°角（从胸部向上）插入剑突过程的解剖左侧，并缓慢推入胸部，同时用活塞保持轻微的负压（见注A3）。当你到达心脏时，你可能会感到抵抗，但这并不总是这样
8. 一旦你到达了心脏，少量的血液将进入注射器。释放负压。放开前肢，用你的非优势手稳定注射器。用你的惯用手慢慢地拉回注射器。
9. 收集所需量的血液后（参见注释A4），通过推入柱塞轻轻地施加小的正压力，然后将针头拉出。一点正压将防止针头缩回期间溶血（见注释A5）。
10. 立即将注射器中的血液转移到1.5ml微量离心管中。为此，从注射器中取出针头，轻轻地将血液排入试管。血液将开始凝结，如果这个步骤做得太快，它将引起溶血。
11. 在室温（RT，?22℃）下放置30-60分钟，或将管置于隔热泡沫容器中的冰上，盖子关闭至少30分钟和至多9小时（见注A6和代表数据）。
12. 按照您机构的动物使用指南，按照推荐的物理安乐死方法（例如，气胸，颈椎脱臼）。
血清分离
本节介绍准备血清样品进行渗透压测量所需的血液处理
1. 将血样以6000×g离心5分钟。所得的深和深红色沉淀将含有血细胞。透明的，灰白色至黄色的上清液层将含有血清。 1.5ml血液提供约0.5-0.7ml血清（见注释B1和B2）。
2. 吸取上清液到新鲜的微量离心管中。当收集血清时，不要打扰沉淀。
3. 储存在4°C，直到准备进一步处理，确保盖子完全关闭，以防止蒸发
渗透压测量
本节首先通过测量已知摩尔渗透压浓度值（290 mOsm/kg对照溶液）的溶液，然后通过测量血清渗透压浓度的方法来验证渗透压计的可靠性。
1. 确保您的渗透压力计最近已按照制造商的指南进行校准，并且运行状况良好。
2. 这是测试渗透压力计的质量控制步骤（见注释C1和C2）。
3. 检查血清样品底部的残留物。如果存在残留物，将样品再次以6000xg离心2.5分钟，并将血清移至新鲜的微量离心管中。
4. 涡旋样品5秒。
5. 使用步骤C2中描述的相同技术测量血清渗透压，在每次测量之间短暂涡旋（?3秒）血清。（见注释C1和C2）。
6. 当所有测量完成后，按照制造商的指南清洁冷却室。
7. 报告最终值作为所有血清渗透压浓度测量的平均值。

笔记

心脏穿刺
1. 任何血液收集方法足以用于测量血清渗透压浓度的目的。我们概述了原始文章（Stare等人。，2015）中所述的心脏穿刺方法。
2. 由于心脏穿刺是终末放血过程，因此不需要保持体热。在整个过程中异氟醚可以保持在最大水平（5％）。
3. 根据大鼠的大小，需要插入大约40-70％的针。如果针完全插入并且在注射器中没有血液的指示，则很可能心脏已经丢失。在这种情况下，请取出针头，不要将其从胸腔中取出，然后重试。如果再次尝试不成功，请更换新针。有时尝试不成功，因为针被阻塞。
4. 100-300g大鼠将提供> 5毫升的血液，但只需要?0.15毫升的血液产生最小量的血清（3×20微升，见注释C1）渗透压测量所必需的。该协议描述了1.5ml血液的收集，因为它是我们通常为我们自己的实验收集的量（Stare等人。，2015）。
5. 溶血是红细胞的破裂，并且可以通过从黄色/白色到红色的颜色变化在血清中目测检测。溶血可以改变血清的组成，从而潜在地改变血清渗量浓度测量（Lippi等人，2012）。
6. 血清和血浆之间的差异是血清不含凝血剂。因此，重要的是允许血液在离心样品之前完全凝结。在全血样品离心之前的存储时间和温度推荐是变化的，并且是今天讨论的（Abbadi等人，2014; Curia等人，2009; Seifarth然而，我们通常将样品置于隔热泡沫容器中的冰上，盖子关闭长达9小时，没有任何不良影响（见代表数据）。一旦分离血清，可以在4℃下储存长达24至48小时（参见代表性数据; Curia等人，2009）。
血清分离
1. 如果血清层含有眼睛可见的颗粒，则以6,000×g离心样品2-5分钟，并将血清收集到新的微量离心管中。
2. 偶尔在血液离心后血清层中出现增稠的灰白色物质。有两个选择要考虑：或者在6,000英寸xg 重新离心2.5-5分钟，或者尽可能收集周围的血清。
渗透压测量
1. 列出的渗透压计每个测量使用20μl，分辨率为±1 mOsm/kg。然而，我们保留至少200μl的血清样品。
2. 在取样之间保持微量离心管的盖子关闭，以防止蒸发
3. 当使用取样器时，确保严格遵循制造商的指南，以获得可靠和可测量的20μl样品。这将包括确保样品中没有气泡，并保持一致的弯月面水平。一致性非常重要，因为这些细微的差异可能导致与可能模拟渗透计或取样器柱塞丝劣化的校准问题的测量不一致。
4. 如果对照溶液的测量值超出标准的规定值，请重新校准渗透计
5. 如果测量的血清渗透压值每次测试一致地变化超过3mOsm/kg，根据制造商的指南用酒精清洁冷冻室。如果值仍然高度可变，请按照制造商的指南更换进样器中的柱塞线。

代表数据

我们调查不同的凝血时间和温度对立即和冷藏一天后测定的血清渗透压浓度测量的影响。我们发现，对于在室温（RT，?22℃; 30分钟和60分钟）或冰（?0℃; 30分钟，60分钟，90分钟，和9小时;图2A和2B）。我们还发现血清样品在4℃下稳定一天（图2C）。

实验设计
使七只成年雄性Westar大鼠进行上述心脏穿刺程序。将收集的血液分成六个1.5ml微量离心管，并在室温或冰上在隔热泡沫容器中凝结，盖子关闭不同的时间。如上所述分离每个血清样品，并等分到2个微量离心管中：一个管用于立即重量摩尔渗透压浓度测量（时间点'0h'，另一个管在4℃保持一天（时间点'24h报告的值是每个样品3-7个测量的平均值，具有±SEM，和指定的标准偏差（SD）。使用SigmaPlot 12和Prism 6进行统计分析和绘图，以通过单因素方差分析（One Way ANOVA） > t -test。 P 值<0.05被认为是重要的。
结果

表1.用于绘制标准曲线的示例数据

图1.用于测试本研究中使用的渗透压计的校准和性能的标准曲线

表2.样本数据

图2.储存温度和持续时间对血清渗透压的影响 A.血液样品（每种n = 7）的血清渗透压值允许在室温下凝结30分钟至9小时?22℃）或在冰上（?0℃）。在类别之间没有统计学差异（单因素方差分析，单位方差分析（5,36）= 0.472，P = 0.795）; B.渗透压值归一化到RT-30min; C.一天冷藏（4℃）对血清渗透压值的影响。在立即测量的样品与在4℃下储存一天（0小时）的样品之间没有统计学差异（配对t检验，P = 0.241），303.72±0.44mOsm/kg，n = 26; 24小时，303.146±0.60mOsm/kg，n = 26）。

致谢

该协议是出现在Stare等人中的材料和方法 - 血清渗透压协议的扩展版本。（2015）。它已经改编自McGill标准操作程序＃111-大鼠麻醉，＃301-啮齿动物安乐死和＃403-血液收集量和频率指南，并且由McGill大学的设施动物护理委员会批准。步骤C2和C5基于Advanced Instruments，Inc。提供的Ease-Eject ^?取样器（20μl）用户指南。该工作由加拿大健康研究所（CIHR）Foundation Grant FDN -143337和James McGill研究主席CWB，CIHR Frederick Banting和Charles最佳加拿大研究生奖学金 - 博士学位奖魁北克研究基金 - 健康支持麦吉尔大学健康中心的研究所。作者感谢M. Prager-Khoutorsky博士和M. Verway博士对这份手稿提出建设性意见。

参考文献

Abbadi，A.，El-Khoury，JM和Wang，S.（2014）。
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Lippi，G.，Cervellin，G.，Favaloro，EJ和Plebani，M.（2012）。体外溶血对实验室测试的影响。和Plebani，M。（Eds。）。体外和体内溶血：实验室医学中未解决的争议：39-44。
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Reddi AS（2013）。水平衡障碍：高钠血症。 In：Reddi AS（Ed。）。流体，电解质和酸碱失调。 Springer，133-150
Seifarth，CC，Miertschischk，J.，Hahn，EG和Hensen，J.（2004）。测量健康年轻人中血清和血浆渗透压 - 时间和储存条件的影响。临床化学实验室Med（临床化学实验室）42（8）：927- 932。
Stare，J.，Siami，S.，Trudel，E.，Prager-Khoutorsky，M.，Sharshar，T.和Bourque，CW（2015）。腹膜脓毒症对大鼠中枢神经调节神经元介导口渴和加压素释放的影响 J Neurosci 35（35）：12188-12197。