材料和试剂

培养皿（60×15mm）（SARSTEDT，目录号：82.1194.500）
50ml Falcon管（SARSTEDT，目录号：62.559.001）
15ml Falcon管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
0.45μm过滤器（Carl Roth，目录号：P667.1）
10ml注射器（Carl Roth，目录号：C542.1）
野生型（MT1131）或突变体菌株
BactoTM胨蛋白胨（BD，目录号：211820）
Bacto TM酵母提取物（BD，目录号：212720）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Carl Roth，目录号：5239.1）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Carl Roth，目录号：2189.2）
MPYE琼脂培养基（1.5％琼脂在MPYE培养基中; 25ml /培养皿）
Chelex 100树脂（Bio-Rad Laboratories，目录号：1422832）
Tris/HCl，pH7.5（Carl Roth，目录号：5429.2; P074.1）
蔗糖（MP Biomedicals，目录号：04821713）
溶菌酶（Sigma-Aldrich，目录号：L2879）
EDTA（Carl Roth，目录号：8043.2）
Lowry蛋白测定试剂[Reagent A，Folin& Ciocalteu的酚试剂（Sigma-Aldrich，目录号：F9252），1％SDS/0.1N NaOH]
SDS（??SERVA电泳，目录号：20765.03）
蛋白质测定牛血清白蛋白（Carl Roth，目录号：8076.4），标准品（0,0.02,0.04,0.08,0.12,0.2mg/ml蛋白质）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Carl Roth，目录号：8563.1）
氢氧化钠（NaOH）（Carl Roth，目录号：6771.1）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（Carl Roth，目录号：P024.1）
酒石酸钠（EMD Millipore，目录号：106663）
53％硝酸的超纯水（Carl Roth，目录号：9274.1）中
30％过氧化氢（Carl Roth，目录号：9681.1）
超纯水（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：BarnsteadTMGenPure ^TM）
氯化钯（II）（VWR，目录号：AA11034-09）
氯化镁（MgCl 2）（VWR，目录号：AA42843-22）
铜标准[（20,40,60ppb Cu在超纯水中;从用于AAS的TraceCert铜标准稀释（在2％硝酸中的1,000mg/ml Cu，用高纯度Cu金属制备）]（Sigma-Aldrich，目录number：38996）
MPYE媒体（见配方）
无铜MPYE（参见配方）
无铜水（见配方）
球状体缓冲液（参见配方）
裂解缓冲液（见配方）
用于Lowry测定的试剂A（参见配方）
AAS调节剂溶液（参见配方）

设备

1.5ml比色皿（Carl Roth，目录号：Y195.1）
磁搅拌板（Heidolph，型号：Hei-VAP）
无菌接种环（Carl Roth，目录号：6163.1）
在35℃下孵育细菌生长的培养箱多细胞标准（Infors，模式：INFORS HT）
250ml锥形瓶（Carl Roth，目录号：K184.1）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Sorvall Lynx 6000）
显微镜在100倍放大，数值孔径1.4（奥林巴斯，型号：BX51）
1000μl自动移液管（Gilson，目录号：F123602）
在60℃和80℃下孵育样品的孵育器（Kühner，型号：ISF-1X）
原子吸收分光光度计（PerkinElmer，型号：4110ZL Zeeman）
VIS分光光度计，能够读取OD 660和OD?? 685（例如，GE Healthcare Life Science，型号：Ultrospec 3100 Pro）。

软件

Excel 2007（Microsoft）
Perkin-Elmer AAWinLab软件

程序

毛红细菌和原生质体制备物的生长，无铜MPYE和无Cu水的制备
1. 在MPYE琼脂板（?24小时，35℃）上，在所需的红细菌菌株的无菌条件下培养培养物，包括抗生素（如果需要）。
2. 准备用于液体培养的MPYE培养基，无铜MPYE和无铜水（见配方）。
3. 使用无菌接种环挑选单个菌落，接种10ml MPYE在50ml Falcon管中。如果需要，添加适当的抗生素。在35℃和110rpm下在旋转振荡器中培养过夜培养物
4. 第二天：用来自过夜培养物的10 8个细胞接种主培养物（在250ml烧瓶中的100ml MPYE），并在35℃，110rpm温育直至培养物达到OD 685 1（约24小时，假设OD 685 = 1对应于7.5×10 8个细胞/ml）。这对应于R的晚指数生长期。 capsulatus 。
5. 使用预冷却的Lynx 6000离心机（4℃），以5,000rpm（对应于F12-6x500LEX转子中的3,000xg），收获细胞20分钟。
6. 倾析上清液并将沉淀物重悬于40ml预冷却的无铜MPYE中，并在4℃下以5,000rpm（3,000xg，F12-6x500LEX转子）再离心20分钟。
7. 滗析上清液，并将沉淀物重悬在2ml原生质球缓冲液中，取一小份50μl用于通过Lowry测定法（参见数据分析）测定蛋白质浓度，例如。
8. 将细胞悬液分成两等份，放入两个干净的15ml Falcon管中。一个管用于测量全细胞中的铜浓度，而另一个管中的细胞用于原生质球制备。这允许测量细胞质（原生质球），周质（原生质体制备后的上清液）和全细胞中的铜含量。
9. 原生质体制备
  1. 向稀释度为1:10的原生质体样品部分中加入裂解缓冲液，以达到终浓度为0.1mg/ml的溶菌酶，例如向900μl样品中加入100μl裂解缓冲液。
  2. 将细胞悬浮液在冰上孵育15分钟，同时轻轻搅拌，即每几分钟将管颠倒几次。 15分钟后，大多数细胞被转化为原生质球;其他革兰氏阴性细菌可能需要更长时间的孵育。
  3. 通过使用显微镜监测原生质体形成。
  4. 通过在4℃下以5,000rpm（3,000xg，F12-6x500LEX转子）离心20分钟收集原生质球。
  5. 小心地收集上清液（周质），优先使用1000微升自动移液管到一个干净的15毫升Falcon管。
  6. 用1 ml原生质球缓冲液重悬沉淀（细胞质）
  7. 从每个部分取50μl的等分试样，并测量所有样品的蛋白质浓度
    
    图1.监测原生质体形成。以100×放大倍率观察到的 R.capsulatus 细胞。 B.在100×放大率下观察球形体形成。球状体由箭头指示。
通过原子吸收光谱法测定Cu浓度
1. 向大约1ml全细胞，原生质球和上清液（在原生质球制备后）在15ml Falcon管中，加入1.5ml的53％硝酸。该处理和在高温下的以下温育完全使蛋白质溶液变性并释放任何结合的金属。在80℃下孵育1小时，随后在60℃下振荡过夜
2. 过夜孵育后，通过加入300μlH 2 O 2（30％水溶液）停止消化，并通过以下方法将样品调节至10ml的最终体积：加入无Cu水。
3. 如果观察到任何不溶性杂质，则将溶液通过0.45μm一次性注射器过滤器过滤。所制备的样品现在是稳定的，并且可以在室温下储存几天
4. 使用原子吸收分光光度计测量3次3秒的雾化来测量铜含量。加载20μl样品和5μl含有0.005mg钯和0.003mg镁（作为电离剂）的改性剂。
5. 使用蛋白质浓度和铜测量绘制数据。计算10ml样品的总铜量，并通过蛋白质定量测定计算的总蛋白质质量和使用下式计算添加硝酸前的样品体积除以：
  μgCu/mg蛋白=（X Cu ppb×10ml）/（Xmg/ml蛋白×Xml样品体积）
  注意：Cu ppb指Cuμg/L。

数据分析

在Trasnea等人中可以找到表明在红细菌中的细胞铜含量的测定的代表性实验。（2016年）。需要两种周质铜伴侣之间的合作以用于cbb 型细胞色素氧化酶和铜稳定红细胞中的铜稳态的完全活性。
下面描述用于确定荚膜红细菌细胞/细胞提取物中的蛋白质浓度的excel BSA标准曲线的实例。将样品在200μl的1％SDS/0.1N NaOH中稀释，加入1ml试剂A，随后在室温下温育5分钟。然后，将100μlFolin&加入Ciocalteu的酚试剂1N，孵育45分钟后，测定A 660处的吸光度。使用标准曲线（如下所述）将吸光度与蛋白质浓度相关联
表1. BSA蛋白标准品及其在A660 的相对吸光度

使用VIS分光光度计测定吸光度读数，随后绘制数据，如图2所示

图2. BSA蛋白标准曲线对于0-0.2mg/ml的BSA蛋白标准品范围测定A660（nm）处的吸光度。使用y = mx绘制最佳拟合的线（MS Excel 2007）。通过将它们的吸光度与x轴上的蛋白质浓度相关联来确定样品的蛋白质浓度
使用Perkin-Elmer AAWinLab软件的原子吸收光谱法的Cu标准及其消光值的代表在表2中提供。图3包含使用Microsoft Excel（在过程中由Perkin-Elmer AAWinLab软件自动产生）的示例性标准曲线，。

表2. Cu标准及其在324.8 nm处的消光

随后使用Perkin-Elmer AAWinLab软件或MS Excel绘制数据，如图3所示。

图3.Cu浓度标准曲线。使用通过AAS获得的值，使用Microsoft Excel生成曲线。对于0-60ppb的Cu的范围确定324.8nm处的消光标准。使用该曲线，可以通过将它们的消光与x轴上的Cu浓度值相关联来确定来自细胞和不同细胞区室的铜浓度。

笔记

该方案被优化用于测量红细胞杆菌的细胞内铜浓度。对于其他细菌，使用适当的生长培养基与适当的抗生素和生长条件。在OD 685 = 0.8的晚指数生长期收获的细胞中测定Cu。该方法还应该与在不同生长阶段收获的细胞一起工作，但是这里不对其进行分析。
周质提取的溶菌酶处理针对R优化。 capsulatus ，因此对于革兰氏阴性菌。由于溶菌酶不能可靠地作用于所有革兰氏阴性细菌，因此可以在这些情况下测试不同的胞壁酰胺酶例如变溶菌素。
使用所获得的铜浓度，可以通过使用以下公式将样品的铜含量除以电池隔室的体积来计算电池隔室中的铜的摩尔浓度：
μmol/L Cu =（Xμg/L Cu×A）/（63.546g/mol×B×C）
A =样品体积（通常为0.01L）[L]
B =样品中的细胞数（通过OD测量或通过细胞的显微计数确定）
C =一个细胞或细胞室的估计体积[L]
63.546g/mol对应于Cu的分子量示例：
假定细胞质液加上一个红细胞脓毒细胞的内膜具有1.9×10 16 -16μL的体积（基于Cyber??Cell数据库计算; http://ccdb.wishartlab.com/CCDB/），铜的摩尔浓度在细胞质中约为300μM

食谱

MPYE媒介
0.3％（w/v）Bacto TM sup-蛋白胨 0.3％（w/v）Bacto TM上海酵母提取物 0.1％（v/v）1 M CaCl 2 2·2H 2 O
0.1％（v/v）1M MgCl 2 6H 2 6H 2 O 蒸馏水，高压釜
无铜MPYE和无铜水
将5g Chelex 100树脂加入100ml溶液中，并连续搅拌至少1小时然后，通过0.45μm过滤器过滤溶液并高压灭菌经过Chelex处理后，铜浓度低于检测限
球状体缓冲液（储存在4℃或新鲜制备的） 100mM Tris-HCl，pH 7.5
0.5 M蔗糖用Cu游离水制备并从储备溶液（1M Tris-HCl，pH 7.5; 2.5M蔗糖）稀释。储存于4°C。
裂解缓冲液
溶于8mM EDTA的10mg/ml溶菌酶，pH8。终浓度0.1mg/ml
试剂A for Lowry测定
2％（w/v）Na 2 CO 3 3/6 0.1 N NaOH
0.01％（w/v）CuSO 4
0.02％（w/v）酒石酸钠
溶于水
AAS改性剂溶液
0.005mg钯
0.003mg镁超纯水中体积高达5μl

致谢

这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（DFG，HGK），德国学术交流服务（DAAD，到PIT），Else-Kr?ner-Fresenius基金会（DM和MU）和德国 - 法国博士学院膜蛋白和生物膜（DFDK，至HGK）。

参考文献

Ekici，S.，Yang，H.，Koch，HG和Daldal，F。（2012）。 cbb3 型细胞色素c氧化酶生物发生所需的新型转运蛋白 MBio < em> 3（1）。
Rae，TD，Schmidt，PJ，Pufahl，RA，Culotta，VC和O'Halloran，TV（1999）。不可检测的细胞内游离铜：超级氧化物歧化酶的铜伴侣的要求 Science 284（5415）：805-808。
Ralle，M.，Lutsenko，S.（2009）。组织中金属的定量成像。生物金属22（1）：197-205。
Trasnea，PI，Utz，M.，Khalfaoui-Hassani B.，Lagies，S.，Daldal，F.和Koch，HG（2016）。