材料和试剂

25mm培养管（VWR，目录号：212-0304）
锥形管（50ml）（Corning，Falcon ，目录号：352070）
无菌刮刀（VWR，目录号：612-1561）
Falcon 细胞过滤器100μm尼龙（Corning，Falcon ，目录号：352360）
1.5ml微管（Treff，目录号：96.07246.9.01）
2ml微管（Treff，目录号：96.09329.9.01）
Whatman纸无灰盘90mm dimeter（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1441090）
培养皿（90×14mm）（VWR，目录号：391-0439）
葡萄（葡萄（Vitis vinifera）cv.Chardonnay 7535）植物，通过从琼脂Murashige& 在25mm培养管中的Skoog（MS）培养基（Aziz等人，2006）
Pseudomonas fluorescens PTA-CT2（Trotel-Aziz等人，2008）
分生孢子（Bc 630）分离自感染的葡萄，由INRA法国凡尔赛成熟
Aquadem蓝色系列蒸馏水（VéoliaWater Aquadem）
蒸馏水用高压灭菌器Avor Getinge灭菌
乙醇（来自Alcool absolu）（Charbonneaux Brabant，目录号：3077319001001）
Murashige& Skoog培养基（MS）（Duchefa Biochimie，目录号：M0231.0001）
甘油（VWR，目录号：24387-292）
Luria Bertani液体培养基（LB）（Duchefa Biochimie，目录号：L1703.0500）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2773）
（BD，目录号：214010）
琼脂番茄培养基（见配方）

设备

具有光周期的植物生长室（SANYO，型号：MLR-351H）
水平层流柜（ASTEC Microflow，型号：水平层流工作站）
长无菌金属夹（VWR，目录号：232-0084）
品红盒（Sigma-Aldrich，目录号：V8505）
微生物安全柜（Angelantoni Life Science，型号：VBH Compact）
无菌移液管（VWR，目录号：VHPA23004）
28℃培养摇床（New Brunswick Scientific，型号：C24）
具有转子数目的转子的可变速度冷冻离心机×标称最大负载（容量：8×50ml）（Eppendorf，型号：5804R）
分光光度计（Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec 3000）
涡旋混合器（Vortex Genie 2 untimed mixer）（VWR，目录号：58815-232）
Malassez计数室（Marienfeld，目录号：0640610）
玻璃雾化器（VWR，目录号：552-0031）
相机（尼康，型号：D7000）

软件

APS评估2.0软件（ APS，产品编号：43696M5， ISBN 978-0-89054-369-6 ）

程序

植物材料的制备
在15ml琼脂修饰的Murashige-Skoog（MS）培养基（含有0.7％Bacto琼脂）上的结节外植体中微量繁殖葡萄体外植物小植株（葡萄种子枸杞Chardonnay克隆7535））（Aziz等人，2003）在25mm培养管中（图1）。
植物在25℃下以16小时和8小时光周期生长。在无菌条件下（水平层流室），从MS琼脂上轻轻地取出8周龄的体外小植株，并用长的无菌金属夹子转移到含有无菌液体MS培养基的无菌Magenta盒中，然后关闭24小时，然后处理适应。每个洋红盒包含四个无菌盖，其填充有9ml无菌液体MS培养基，并且将每个植物的根独立浸入每种培养基中（图1）。

图1.用荧光假单胞菌接种的程序A.葡萄植物（葡萄（Vitis vinifera）L.cv.Chardonnay）对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）敏感。 B.葡萄植物转移到无菌Magenta盒中，并用根细菌接种荧光假单胞菌 PTA-CT2。
细菌接种物的制备和接种
1. 从-80℃甘油储液（30％）中取出荧光假单胞菌PTA-CT2菌株（Trotel-Aziz等人，2008），在微生物安全柜中使用灭菌的移液管尖端以在无菌Luria Bertani（LB）液体培养基（100μl的甘油储备液，用于10ml培养基）中接种细菌，并在28℃培养摇床中以110rpm生长18小时。
2. 通过在与B1段相同的条件下在含有每40ml LB的10×50ml无菌管中接种1ml等分试样，将该预培养物用于10个新的LB培养物。
3. 在5,000xg离心细菌悬浮液10分钟，并在微生物安全柜中用无菌的10mM MgSO 4溶液洗涤沉淀物并将其重悬于10ml无菌的10mM MgSO 4溶液或MS培养基。
4. 涡旋细胞悬浮液，并通过使用分光光度计检查其在450和600nm（OD <450和OD <600）的光密度。为了制备接种物，在10mM MgSO 4或液体MS培养基中将细菌悬浮液的密度调节至2×10 8 cfu/ml。
5. 用无菌移液管将无菌条件下置于盖子中的每个小植物的根部加入1ml细菌悬浮液，以达到2×10 7 cfu/ml的最终浓度（图2A）。对于对照植物，加入1ml 10mM MgSO 4或液体MS培养基
6. 将细菌和对照植物放在22℃，16和8小时光周期的生长室中。
7. 对于统计分析，至少准备12个生物重复
真菌接种物制备和接种
1. 从-80℃甘油储备液（30％）中取出分生孢子灰霉病菌的分生孢子悬浮液（30％），并在微生物安全柜中使用灭菌的移液管尖端在含有番茄的培养皿上刺破分生孢子琼脂培养基中，并在22℃下在连续光下孵育21天以形成孢子
2. 将10 ml无菌水置于孢子形成的B上。灰霉病菌，并用无菌刮刀刮去B的分生孢子和菌丝体。 cinerea 。
3. 将菌丝体和分生孢子的混合物转移到50ml锥形管中，然后通过涡旋振荡数次以获得水中的分生孢子。
4. 使用过滤管（50ml含有100μM尼龙Falcon 细胞过滤器的管）过滤所获得的悬浮液以除去菌丝体。
5. 使用Malassez计数室测量悬浮液中分生孢子的浓度，并用无菌水稀释至每ml水1×10 6分生孢子的浓度。
6. 用于引发实验和B。灰霉病发展测定，用根瘤处理的植物的叶子喷雾。荧光素PTA-CT2或具有B的接种悬浮液的对照植物。使用雾化器（图2B）在1×10 6分生孢子/ml的情况下进行灰化，直至达到叶的均匀覆盖。
7. 保持植物在22℃的生长室与16和8小时光周期
8. 在接种后24小时收集样品，并用研钵在液氮中研磨叶子，得到保持冷冻的稀粉末。
9. 在预冷的2ml微量管中称取50mg冷冻的新鲜叶粉末，然后在-80℃下储存以进一步进行mRNA提取和定量B的肌动蛋白基因表达。（Gruau等人）中描述的通过qRT-PCR（图2D）来检测细胞灰质（EDN28275.1，GenBank）。（2015）。
10. 用于评价对B的持久耐久性。灰霉病，从5天的细菌或对照植物分离叶（图2C）
11. 将分离的叶子与上表面接触加湿的Whatman纸碟在培养皿中
12. 应用一个针刺伤口到每个叶的中间部分（图2C），并用5μl滴1×10 6分生孢子/ml的悬浮液覆盖新鲜的伤口。 >
13. 保持培养皿中含叶子的培养皿在22℃的生长室，16和8小时的光周期感染后72小时。
14. 用尼康照相机D7000拍摄接种叶的上侧的照片，并扫描它们，然后测量B期间形成的坏死损伤区域。通过图像分析软件，APS评估2.0软件（美国植物病理学会出版社，圣保罗，MN，美国）进行坏死表面定量（图2E）的灰质感染。
  
  图2.用B攻击后用荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）引发植物的程序。灰霉病。用葡萄植物接种后5天。荧光素PTA-CT2在根部水平的洋红盒中（A），来自对照的叶子和处理的植物用B喷雾。灰霉病菌（cinerea）分生孢子（B），或用B分离和滴注。灰霉病菌（C）。在第一次24 hpi期间用喷雾剂B评估病原体的发展。通过定量 B的肌动蛋白转录物水平来确定灰质分生孢子。灰霉病（如在D中），或在感染的叶中（如E中）在72hpi形成的平均坏死区。

数据分析

B的组成型肌动蛋白基因。通过使用特异性引物的定量实时RT-PCR分析完整植物叶片中的灰霉病细胞（参见Grau等人，2015）。使用参照基因EF1α（BQ799343，GenBank）和60RSP（XM_002270599，GenBank）作为内部对照，并且零时感染的植株的叶对应于参考样品（1x表达水平）。所给出的结果是来自三个独立实验的平均值坏死面由B引发。灰皮埃在分离叶上获得与APS评估2.0软件。在一个实验中对每种条件使用约30片叶子，结果是6次独立实验的平均值。 ANOVA检验使用Duncan's多范围检验; 0.05。

食谱

琼脂番茄培养基
25％（v/v）商业100％番茄汁 2.4％（v/v）琼脂

致谢

这项工作部分得到Vineal 2计划的支持，并授予来自香槟 - 阿登地区和兰斯市的C. Gruau和B. Verhagen。该方案改编自Gruau等人。（2015）和Verhagen 等。（2011）。

参考文献

Aziz，A.，Poinssot，B.，Daire，X.，Adrian，M.，Bezier，A.，Lambert，B.，Joubert，JM and Pugin，A。（2003）。 Laminarin在葡萄中引发防御反应，并诱导对灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和 Plasmopara viticola 。 Mol Plant Microbe Interact 16（12）：1118-1128。

Aziz，A.，Trotel-Aziz，P.，Dhuicq，L.，Jeandet，P.，Couderchet，M.，and Vernet，G.（2006）。壳聚糖低聚物和硫酸铜诱导葡萄树防御反应和对灰霉病和霜霉病的抗性。植物病理学 96（11）：1188-1194。

Gruau，C。，Trotel-Aziz，P.，Villaume，S.，Rabenoelina，F.，Clement，C.，Baillieul，F. and Aziz，A。（2015）。 Pseudomonas fluorescens PTA-CT2引发局部和全身免疫反应， Mol Plant Microbe Interac 28（10）：1117-1129。

Trotel-Aziz，P.，Couderchet，M.，Biagianti，S. and Aziz，A.（2008）。新的细菌生物防治剂不动杆菌，芽孢杆菌，泛菌和假单胞菌介导对灰葡萄孢的葡萄抗性。环境和遗传学64（1）：21-32。

Verhagen，B.，Trotel-Aziz，P.，Jeandet，P.，Baillieul，F.and Aziz，A。（2011）。通过葡萄相关细菌改善对灰葡萄孢菌的抗性，诱导初次氧化爆发和植物抗毒素生产。 em> Phytopathology 101（7）：768-777。