材料和试剂

培养皿（100mm）
注意：根据每个研究者的偏好和可用性，可以使用任何培养皿。
猎鹰管
移液管3.5ml（SARSTEDT，目录号：86.1172.001）
50ml锥形管（SARSTEDT，目录号：62.547.004）
注射过滤器，0.2μm孔径（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
细胞过滤器70μm（Corning，Falcon ，目录号：352350）
细胞培养处理的烧瓶（25cm 2）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：136196）
将细胞培养处理的烧瓶（175cm 2）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：178883）
细胞培养处理的烧瓶（80cm 2）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：178905）
小鼠
乙醇
注意：根据每个研究者的偏好和可用性，可以使用任何乙醇。
HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14170088）
抗生素 - 抗真菌的（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15240096）
EDTA（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：327205000）
DTT（DL-二硫苏糖醇）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11960044）
胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号：S0115）
青霉素 - 链霉素100x（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺（200mM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-081）
MEM非必需氨基酸溶液（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：11140-068）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）Dulbecco（10x）（Biochrom，目录号：L1835）
两性霉素B（Sigma-Aldrich，目录号：A2942）
来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）III型（Sigma-Aldrich，目录号：C7657）的胶原酶
Dispase II，中性蛋白酶II级，来自多粘芽孢杆菌（Roche Diagnostics，目录号：04942078001）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25300054）
FACS染色抗体和物质
1. Vimentin-A647（Abcam，目录号：ab194719）
2. CD45-PE-Cy5（BD，目录号：553082）
3. 细胞内固定和渗透缓冲液（eBioscience，目录号：88-8824-00）
HBSS /抗生素（参见配方）
HBSS/EDTA/DTT（参见配方）
消解解决方案（参见配方）
DMEM介质（参见配方）

设备

解剖工具包

两把剪刀（至少一个中号和一个小号）
两只镊子
注意：根据每个研究者的偏好和可用性，可以使用任何剪刀和镊子。
装配有用于冲洗肠的21号针（BD，Plastipak ^TM，目录号：308063）的10ml注射器

细胞培养罩
细胞培养温箱，37℃，5％CO 2/s
摇水浴
离心机与50ml锥形管相容
用于细胞培养的明场倒置显微镜
多色FACS分析仪（BD，型号：BD FACS Canto II）

软件

FlowJo软件（Tree Star Inc.）

程序

在长凳
1. 按照机构动物护理和使用委员会批准的指南，通过CO 2窒息将小鼠安乐死。
2. 用70％乙醇消毒腹部皮肤并打开它
3. 取出结肠和/或7-8厘米的小肠（从盲肠到胃），并分别放置在装有冰冷的HBSS /抗生素的培养皿中（图1）。
  注意：最好避免细胞与结肠和小肠分离，因为它们在消化溶液中需要不同的孵育时间。
  
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  图1.小鼠肠道的解剖。 A.去除皮肤，暴露腹部。 B.小心打开腹膜以暴露肠。 C.从腔中取出肠以暴露胃和肛门（由箭头指示）。 D.小肠从肛门小心地移至胃。取出结肠和小肠，并置于单独的培养皿中。指示肠部分。
4. 使用装有21号针的10ml注射器（图2A）通过用HBSS /抗生素冲洗来重复洗涤肠部分。将组织放在预湿纸上，去除脂肪和粘附结缔组织（图2B）。纵向切开肠组织，并在冰上每只小鼠放在冰冷管中的10ml冰冷的HBSS /抗生素中（图2C）。
  注意：
在细胞培养箱
1. 用冰冷的HBSS /抗生素（约10ml）冲洗结肠或小肠至少3次，通过剧烈摇动试管，除去上清液，每次加入新的HBSS /抗生素。
2. 将组织放置在培养皿中，并用剪刀和镊子帮助下切割0.5-1厘米的组织。
  注意：剪刀和镊子可以在插入细胞培养罩之前进行灭菌。或者，剪刀和镊子可在使用前用70％乙醇喷雾。它们可以保存在70％乙醇中，并在肠道操作之前或在样品之间出现在无菌水中。
3. 用冰冷的HBSS /抗生素（约10ml）洗涤一次，并剧烈摇动，并除去上清液。
4. 加入10ml预热的HBSS/EDTA/DTT溶液，并在37℃下在振荡水浴（〜200rpm）中孵育20分钟以除去肠上皮细胞（结肠和小肠两者）。 br />
5. 通过剧烈摇动试管〜15秒，用HBSS /抗生素（可以在室温下）洗肠段至少3次，除去上清液，每次加入新的HBSS /抗生素。最后一次洗涤后，上清液应不再浑浊。倾析细胞过滤器（70μm），以去除所有液体，并放置在新的猎鹰管中。
  注意：EDTA可以抑制胶原酶，因此必须完全去除。
6. 加入10ml消化溶液并在37℃下在振荡水浴（〜200rpm）中孵育1小时（结肠）或30-40分钟（小肠）。
  注意：您应该会看到上层变得浑浊，组织更透明，但不完全溶解（图3）。
  
  图3. 酶消化前后的肠组织。箭头表示酶消化后存在一些完整组织。
7. 剧烈摇动并将上清液放置在新的falcon管中。
  可选：您可以通过细胞过滤器（70μm）传递su 上下文。
8. 在室温下280℃离心10分钟。
9. 将细胞沉淀重悬于5-6ml DMEM培养基+两性霉素B（2.5μg/ml）中，并置于每只小鼠25cm 2的培养瓶中。
  重要：2-3小时后，您可以注意到细胞粘附在烧瓶底部（图4A）。第二天更换培养基。
10. 每天观察细菌污染的迹象，每2-3天喂食一次。通常在4-5天，细胞汇合，并可以传代至75cm 2烧瓶（图4B）。
  
  图4.在铺板（A）和第2代（P2）（B）后细胞培养物中来自IMC的代表性图像。在（A）中，连接到烧瓶的所选细胞由箭头指示放大镜10x）。
11. 细胞的传代可通过每次用10ml的1x PBS洗涤细胞两次（用10x PBS稀释至1x H 2 O）两次，并加入胰蛋白酶/EDTA（1ml，对于25cm 3） 2烧瓶）。用胰蛋白酶/EDTA孵育5分钟，在室温下应足以使细胞分离。然后加入DMEM培养基以灭活胰蛋白酶，并以1:2的比例分裂细胞。
12. 在第一次传代后，细胞通常每3-6天以1:2的分流比传代（当细胞几乎100％汇合时总是分裂）。每2-3天饲喂一次。在第1和2代，两性霉素B以0.25μg/ml加入，第3代省略。
13. 在第3代，用FACS分析检查细胞的纯度。在这一阶段，培养物通常是CD45（<3-4％），因此对于造血细胞是阴性的，并且可以用于随后的实验中。波形蛋白，细胞内细胞骨架蛋白，可以用作阳性标记，并且应该染色> 90％的细胞（参见图5中的流式细胞术分析的实例和"注释"部分下的FACS染色细节）。
  
  图5.在第3代（P3）
  的分离的IMC的代表性FACS分析
14. 尝试在3-5代之间使用隔离的IMC，并且不要保持它们超过一个月，或者如果注意到其形态的变化。一个175cm 2烧瓶通常产生3-6×10 6个细胞。
15. 细胞可用于几种功能和生化测定。第二天电镀细胞浓度达到〜80％汇合如下：

笔记

上述方案涉及使用1只小鼠/样品。您可以从3只小鼠分组结肠或小肠，加入15毫升HBSS/EDTA/DTT和15毫升消化溶液。在这种情况下，在步骤B1和B5中上清液澄清之前可能需要更多的洗涤。在方案结束后，您可以将分离的细胞在75cm 2烧瓶中铺板。
在分离后和第一次细胞传代之前，细菌污染的可能性增加。为此，尝试改变培养基2-3小时或隔离后的第二天，每天检查细胞，每2-3天更换培养基。确保始终添加指定浓度的两性霉素，优选制备新鲜的两性霉素补充的DMEM培养基并适当处理，因为它是光敏感的。
FACS染色

首先在PBS/5中的100μl样品（1-2×10 6个细胞）中进行CD45的细胞染色（0.2μl每1-2×10 6个细胞）％FBS，在4℃在黑暗中孵育30分钟，然后用FACS缓冲液（PBS/2％FBS）洗涤两次。
然后将细胞固定并透化，使用Fixation&渗透试剂盒在室温下40分钟，然后用1x渗透缓冲液（Perm缓冲液）洗涤两次。
然后在室温下在100μl1×Perm缓冲液中用波形蛋白（0.2μm每1-2×10 6个细胞）进行细胞染色1小时，随后用Perm缓冲液洗涤一次使用FACS BD Canto II细胞仪和FlowJo软件在分析前用FACS缓冲液洗涤

在肠发炎的情况下，可以注意到更多数量的CD45 ⁺细胞。在这种情况下，如果这是您的后续实验的问题，您可能必须添加额外的磁珠消耗或细胞分选步骤。
不推荐对原代肠间充质细胞进行冷冻保存。

食谱

HBSS /抗生素
5ml在500ml HBSS中的抗生素 - 抗生素注意：使用前应冷。
HBSS/EDTA/DTT
5 mM EDTA
1 mM DTT
1x pen/strep
溶解在HBSS中
注意：使用前在37°C预热。
消化解决方案
300U/ml胶原酶XI 0.08 U/ml分散酶II
溶于DMEM培养基中
注意：消解溶液应该是新鲜的。根据您将使用的小鼠的数量称重适量的胶原酶和分散酶，并在HBSS中以1/10的最终体积稀释。通过0.2μm孔径的注射器过滤器对溶液进行无菌过滤，然后加入DMEM培养基至最终体积。
DMEM培养基
50 ml热灭活的FBS
5ml pen/strep
5ml L-谷氨酰胺 5ml非必需氨基酸
溶于500ml DMEM中
注意：

除了消解溶液之外的所有介质都可以提前制备，并储存在4℃。
在37°C预热，然后使用。

致谢

该协议基于我们实验室中使用的先前协议（Armaka 。这项工作得到FP7高级ERC拨款MCs-inTEST（授予协议号340217）和创新药物倡议联合承诺（IMI JU）项目BTCure（授予协议No.115142）GK支持。

参考文献

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Koliaraki，V.，Roulis，M.和Kollias，G。（2012）。 Tpl2调节肠肌纤维母细胞HGF释放以抑制结肠炎相关的肿瘤发生。 122（11）：4231-4242。 br />

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Powell，DW，Pinchuk，IV，Saada，JI，Chen，X.and Mifflin，RC（2011）。肠粘膜固有层的间质细胞。：213-237。

Roigan，M.，Nikolaou，C.，Kotsaki，E.，Kaffe，E.，Karagianni，N.，Koliaraki，V.，Salpea，K.，Ragoussis，J.，Aidinis，V.，Martini， Becker，C.，Herschman，HR，Vetrano，S.，Danese，S.和Kollias，G。（2014）。肠道肌成纤维细胞特异性Tpl2-Cox-2-PGE2通路将先天感知与上皮内环境稳定联系起来。 111（43）：E4658-4667。