材料和试剂

10-20μl移液器吸头
石蜡膜（Cole-Parmer，目录号：PM996）
Eppendorf管（Eppendorf，目录号：022364111）
毛毡尖标记（Sharpie，细点永久标记）
鼠标（C57BL/6）
四甲基罗丹明-5-（和-6） - 异硫氰酸酯（TRITC）（Thermo Fisher Scientific，目录号：T490）
丙酮（Chem Supply，目录号：AL008-2.5L-P）
DMSO（二甲基亚砜）（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
Veet（敏感性皮肤脱毛膏）（Reckitt Benckiser）
眼凝胶（例如，Poly Visc，Alcon Laboratories）
Ilium Ketamil（Ketamine）（Troy Laboratories）
Ilyl Xylazil-20（甲苯噻嗪）（Troy Laboratories）
氯胺酮/赛拉嗪溶液（参见配方）

设备

10-20μl移液器
小铲
称重0.1μg的精细天平
Wahl超级修剪器（Wahl，目录号：5996415011081）
热垫（Stoelting，型号：50300）
快船
薄纸/纱布
标尺

程序

准备TRITC解决方案
注意：TRITC解决方案在使用前准备新鲜。
1. 称量少量（例如。，0.1μg）TRITC晶体到方形石蜡膜上。 TRITC的量取决于使用所需的体积（见步骤B7）
2. 在每μl0.1μgTRITC在Parafilm上溶解1μlDMSO
3. 在Eppendorf管中制备丙酮并将溶解的TRITC/DMSO溶液转移到丙酮中以稀释至0.5-1％（v/v）（例如，在200μl中的1-2μlTRITC/DMSO 丙酮）。
4. 用移液管彻底混合管。
TRITC绘画
1. 通过腹膜内注射用氯胺酮/赛拉嗪（10μg/g体重）麻醉小鼠（例如。，C57BL/6）。
  注意：
  1. 此程序应适用于所有用于研究的小鼠品系。
  2. 涉及动物的所有程序必须根据经过适当培训和认证的人员的认可机构，地区或国家协议（如适用）进行。
2. 将镇静的鼠标放在加热垫上，并对每只眼睛涂一滴眼胶
3. 使用剪刀刮鼠标的侧腹。
  注意：我们已经在小鼠的侧腹/背部皮肤测试了这种方法，但是它应该适用于所有其他皮肤部位适当的脱毛之后。。
4. 应用Veet剃毛的皮肤2分钟彻底脱毛的头发。用棉纸或纱布擦拭奶油。
5. 用棉纸或用水浸湿的纱布清洁暴露的皮肤，然后用干纸巾擦干皮肤
6. 使用毡尖标记和标尺，标记要涂漆的皮肤上的区域（图1，左）。为了防止在施加TRITC时墨水被吸收，请将皮肤标记为比所需尺寸宽〜2-3 mm。
7. 使用P20移液管，将TRITC溶液彻底混合并缓慢地滴加到目标区域，逐滴（图1，右图。我们使用10μl染料/丙酮混合物用于〜1cm 2 /使用的体积应相应地缩放）。染料应在几秒钟内吸收到皮肤中。
  
  图1.准备染料染色的鼠标。剃刮并清洁鼠标的侧面皮肤，标记出想要绘制的区域（左），然后用移液管将染料/丙酮混合物慢慢地涂抹到皮肤上）。
8. 放置鼠标其侧，以允许画的位置干燥（约10-15分钟）。将鼠标放在加热垫上，直到醒来（约1小时，直到从麻醉中恢复）。
  
  图2. TRITC绘的鼠标。染料/丙酮混合物应该相对较快地吸收到皮肤中。将鼠标从侧面，在加热垫上，以允许涂漆的地方干燥
9. 下游应用包括使用流式细胞术，免疫荧光显微镜或双光子活体显微镜检查排出LN中的迁移细胞（图3，参见下面的注释1和2）。

代表数据

图3.使用双光子活体显微镜的TRITC标记的DC成像的实施例（图1）使用双光子活体显微镜观察TRITC标记的DC成像的实施例。显示的是描述TRITC 标记的迁移性DC（红色）以及它们与小鼠腹股沟淋巴结的T细胞区中的CellTrace紫罗兰标记的CD4T细胞（绿色）的相互作用。比例尺，50μm。

笔记

染料是光稳定的，并且可以维持重复暴露于激光激发
对于双光子成像，TRITC可利用Ti：Sa激光器在800-880nm范围内激发。
我们观察到只有非常低水平的染料引流至引流LN，其中大部分保留在囊下窦中或由沿着LN周边的巨噬细胞捕获。另一方面，由染料标记的细胞可以通过其高荧光强度容易地区分。可以通过流式细胞术或免疫荧光共聚焦显微镜来鉴定TRITC涂覆的迁移物。在我们的皮肤HSV感染的实验中，引流LN中的大多数TRITC 细胞似乎是CD11c ^{+ MHC-II ^hi他们是迁移性DC}
我们观察到在绘画后几个小时在排水LN中的细胞迁移。这可以反映细胞的内稳态循环，或者由所进行的程序触发的细胞的活化（剃刮，脱毛，染色）。不管什么触发它们的迁移，这些细胞的存在不影响我们检测在病毒感染后从呈递抗原的皮肤到达的迁移性DC的能力。

食谱

氯胺酮/赛拉嗪溶液
对于10ml溶液：
1 ml Ilium Ketamil（Ketamine）
0.75ml Ilyl Xylazil-20（甲苯噻嗪）
8.25ml PBS
存储在4°C
注意：用10μl/g体重麻醉小鼠。

致谢

该方案改编自我们的出版物（Hor等人，2015）。这项工作得到国家卫生和医学研究委员会和澳大利亚研究委员会的支持。

参考文献

Hor，JL，Whitney，PG，Zaid，A.，Brooks，AG，Heath，WRand Mueller，SN（2015）。与树突状细胞亚群的时空不同相互作用促进CD4 ⁺和CD8 ⁺ T细胞活化以局部化病毒感染。免疫 43（3）：554-565。