材料和试剂

带有27号针的1ml TB注射器（BD Biosciences，目录号：309623）
塑料包装
3.5"×3.5"称重舟（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：8732113）
1.5 ml微量离心管
0.45μm过滤器单元（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：09-740-65B）
Amicon Super-15离心过滤器单元（Merck Millipore，目录号：UFC903024）
5 ml管
成年小鼠（> 6周，任何菌株）（例如，Balb/cJ）
（Perkin Elmer，目录号：NEZ037500UC）注意：在〜3μCi/μl的浓度下，我们用于从我们的γ计数器获得体面信号的⁵⁹ Fe的最小比活性为0.2Ci/mmol，这提供了全身计数每分钟〜100,000每只动物。对于⁵⁹ Fe，我们的伽马计数效率约为10％。
次氮基三乙酸（NTA）（Sigma-Aldrich，目录号：N9877-100G）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：AC172570250）
Amicon Super-15离心过滤器单元（Merck Millipore，目录号：UFC903024）
5 ml管
成年小鼠（> 6周，任何菌株）（例如，Balb/cJ）
（Perkin Elmer，目录号：NEZ037500UC）注意：在〜3μCi/μl的浓度下，我们用于从我们的γ计数器获得体面信号的⁵⁹ Fe的最小比活性为0.2Ci/mmol，这提供了全身计数每分钟〜100,000每只动物。对于⁵⁹ Fe，我们的伽马计数效率约为10％。
次氮基三乙酸（NTA）（Sigma-Aldrich，目录号：N9877-100G）
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：AC172570250）
...
Human apo-transferrin (Sigma-Aldrich, catalog number: T2252)
PBS (VWR, Corning^®, catalog number: 21-040-CM)
Sodium chloride (NaCl) (Thermo Fisher Scientific, Fisher Scientific, catalog number: S2713)
Fisherbrand^TM absorbent underpads (Thermo Fisher Scientific, Fisher Scientific, catalog number: 14-206-64)
Radioactive decontaminating solution (Thermo Fisher Scientific, Fisher Scientific, catalog number: NC9633347)
20 mM Fe-NTA (1:4) (see Recipes)
Ferric citrate solution (see Recipes)
⁵⁹Fe-labeled ferric citrate solution (see Recipes)
⁵⁹Fe-labeled transferrin (see Recipes)
0.9% NaCl solution (see Recipes)

Equipment

Gamma counter (Perkin Elmer, catalog number: 2480-0010)
The program for ⁵⁹Fe detection was set using the following parameters:

Counting window: Dynamic-keV
Peak position: 1292 keV
Low boundary: 1020 keV
High boundary: 1400 keV
Threshold: 20%
Max. assay deviation: 20%
Max. normalization deviation: 50%
Warning assay deviation: 15%
显着CPM/keV：10
计数谱类型：许多峰

γ计数管（5×28mm）和RIA架（Perkin Elmer，目录号：1480-151）

在γ计数之前，测量空的γ计数管以确保没有 Fe污染（即，<25 CPM =背景）。

鼠标限制器（Braintree Scientific，目录号：MTI STD）
小动物基本手术包

程序

对于组织NTBI摄取测量，通过尾静脉向小鼠注射0.1ml柠檬酸铁溶液（含有70μg铁），以瞬时饱和血浆转铁蛋白的铁结合能力。
该步骤是必需的，使得任何随后注射的铁不会结合转铁蛋白，因此将是非转铁蛋白结合铁（NTBI）。将鼠标放回笼中，等待10分钟，然后转到步骤2.请参见图1，了解典型的注射台设置。
对于组织TBI摄取测量，通过尾静脉将0.1ml的59 Fe标记的转铁蛋白（含有150μg转铁蛋白）注射到小鼠。将鼠标放回笼子，等待2小时，然后转到步骤3

图1。尾静脉注射部位（A）和组织收获部位（B）的典型设置
通过尾静脉向小鼠注射0.1ml的59 Fe标记的柠檬酸铁溶液（2μCi）。将鼠标放回笼子 />
在注射59 Fe标记的柠檬酸铁溶液（用于NTBI摄取）或59 Fe标记的转铁蛋白（用于TBI摄取）后两小时，用过量的安慰剂异氟烷或其它合适的方法，并将小鼠放在吸收垫上。切开小鼠尾部以除去保留在尾部的残留的 Fe放射性（即未进入循环的放射性）。参见图1，了解典型的收割站设置
用70％乙醇灭菌小鼠腹部和胸部。用钝端无菌剪刀打开腹腔，并收集感兴趣的组织（例如，胰腺，脾，肝，肾，等）。然后打开胸腔收集肺和心脏等组织。
在0.9％NaCl溶液中冲洗组织，将其倒入一次性称重舟中，并通过将一叠纸巾上的组织擦拭来除去多余的液体。
在转移到γ计数管之前，使用塑料包裹短暂包裹每个组织，以最小化样品之间的 Fe放射性的交叉污染。任选地，如果组织样品可以装入其中，则将组织转移至干净的1.5ml微量离心管。然后使用γ计数器通过将含有组织样品的1.5ml管置于γ计数管架中来测量组织放射性（参见图2）。
对于小鼠胴体，在转移到γ计数管之前，使用塑料包裹物将整个屠体牢固包裹（见图2）。

图2.在通过γ计数器测量之前放射性组织处理和装载到γ计数管的图示。 A.组织样品包装所需的材料。 B.具有先前包裹的样品的γ计数架的顶视图装载在每个γ计数管中。 C.将包含样品管的γ计数架放置在γ计数器的齿条带上，准备装载在γ检测器（左图）内。伽玛计数器屏幕显示从组织样品检测的实时放射性（右图）
使用γ计数器测量器官和胴体 Fe放射性。计算组织NTBI和TBI以每分钟全身计数（CPM）的百分比（全身CPM =来自所有组织的CPM值+来自屠体的CPM值）（见图3）的百分比。

图3.原始数据的实例和结果分析。注射后3小时，用Fe标记的柠檬酸铁，WT和Zip14 KO小鼠注射2小时后，处死并对它们的组织和屠体进行γ计数。记录来自每个样品的每分钟计数（CPM）值。从所有组织和尸体CPM的总和计算全身CPM值。 B.组织59 Fe累积表示为全身的％，并计算为（组织CPM /全身CPM）×100。显示来自图B的结果图。通过使用未配对的学生的测试来分析数据。值为平均值±SE（n = 3 /组）。 *** P 0.001，**

P 0.01

笔记

每次实验后，使用放射性清洁剂清洁外科工具，小鼠笼和相关设备以净化⁵⁹ Fe。在每次实验后进行实验的相关设备和区域进行放射性擦拭测试，以确保没有观察到污染。放射性废物应按照当地环境健康和安全（EH& S）规定处理。

食谱

20mM Fe-NTA（1:4摩尔比） 20mM HEPES/20mM Tris缓冲液
0.4 M NTA
0.4M FeCl 3

制备20mM HEPES/20mM Tris缓冲液
向450ml ddH 2 O中溶解2.38g HEPES和1.21g Tris。
用10N HCl调节pH至6.0 用ddH 2 O使最终体积为500ml。
准备0.4 M NTA
在20ml 20mM HEPES/20mM Tris缓冲液中，加入4.28g NTA 用10N NaOH调节pH至6.0，在开始时加入〜3ml 10N NaOH，然后逐滴加入，直至pH达到6.0（注意：pH在pH 5-7之间迅速变化）。 /> 用20mM HEPES/20mM Tris缓冲液使终体积为56ml
在100mM HCl中制备0.4M FeCl 3 为了制备100mM HCl，将500μl37％（相当于12M）HCl溶液加入到11.5ml ddH 2 O中。
将1.08g FeCl 3·6H 2 O溶解在10ml 100mM HCl中。
制备20mM Fe-NTA（1:4摩尔比）在内部有搅拌棒的50ml烧杯中，加入10ml 20mM HEPES/20mM Tris缓冲液将pH电极留在溶液中，并沿着其余步骤跟踪溶液的pH 加入2ml在步骤1c中制备的0.4M FeCl 3。溶液pH值现在应为〜2 加入8ml在步骤1b中制备的0.4M NTA 用100mM NaOH调节至最终pH为6.95 用20mM HEPES/20mM Tris缓冲液使终体积为40ml 通过0.45μm过滤器单元对20mM Fe-NTA溶液进行过滤灭菌

柠檬酸铁溶液
0.1M柠檬酸盐缓冲液
12.5mM FeCl 3·6H 2 O 2

准备0.1 M柠檬酸盐缓冲液
向40ml ddH 2 O中溶解2.25g Na 3 H 6 H 6 H 5 O 7，/2H·2H 2 O（柠檬酸三钠二水合物）用10M HCl调节pH至6.6 用ddH 2 O使最终体积为50ml。
对于50ml原液，将0.169g FeCl 3·6H 2 O加入到50ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液中。

Fe标记的柠檬酸铁溶液
0.1M柠檬酸盐缓冲液，59μLFeCl 3缓冲液向100μl0.1M柠檬酸盐缓冲液中加入2μCi FeCl 3 子。
混合良好。
⁵⁹ Fe标记的转铁蛋白
10mM NaHCO 3/v/v 18.75μM转铁蛋白
20mM Fe-NTA（1:4摩尔比） ⁵⁹ FeCl <3>

向50ml PBS中加入0.042g NaHCO 3。
将7.5mg载脂转铁蛋白加入到在步骤4a中制备的PBS缓冲液中的5ml NaHCO 3中。
向2.5μl20mM Fe-NTA溶液中加入2.5μl^{59 FeCl 3 3。}
混合在步骤4b和4c中制备的溶液。在室温下孵育1小时以使^{59 Fe结合转铁蛋白}
使用Amicon ^TM Ultra-15离心过滤器单元除去未结合的⁵⁹ Fe。

将4ml步骤4d中制备的59 Fe标记的转铁蛋白加入Amicon TM Ultra-15离心过滤装置中。
在RT下离心5分钟×20分钟，在放射性废物容器中丢弃洗脱液。
将4ml 10mM NaHCO 3（在步骤4a中制备）加入到过滤单元中，并在室温下以5,000xg离心20分钟，弃去洗脱液。
重复步骤eiii 3次。在最后一次洗涤中，您可能希望测量洗脱液中发现的⁵⁹ Fe放射性，以确保未结合TBI的⁵⁹ Fe已被彻底清除。洗脱液⁵⁹ Fe放射性大于30 CPM可能表示需要额外的洗涤。
在过滤器单元的顶部加入4ml的10mM NaHCO 3缓冲液，并收集所有的渗余物（其含有新加入的4ml的10mM NaHCO 3和< sup-> Fe-标记的转铁蛋白，使收集体积为〜4ml）到新鲜的5ml管中。测量 Fe标记的转铁蛋白溶液的 Fe CPM，以确保足够的放射性，从而能够检测来自每只动物的组织相关的59 Fe （期望〜10,000CPM /100μl Fe-标记的转铁蛋白溶液）。储存于4°C，直到用于尾静脉注射

0.9％NaCl溶液，高压灭菌
向每1L ddH 2 O中加入9g NaCl 高压灭菌器消毒，存储在4°C，直到使用。

致谢

这项工作得到国家卫生研究院拨款DK080706（M.D.K.）的支持。该方案改编自Craven等人。（1987），并且在Jenkitkasemwong等人公开了经修改的方案的简短版本。（2015）。

参考文献

Craven，CM，Alexander，J.，Eldridge，M.，Kushner，JP，Bernstein，S.and Kaplan，J。（1987）。 SLC39A14是鼠的肝细胞铁超载的发展所必需的遗传性血色素沉着模型。细胞Metab 22（1）：138-150。