材料和试剂

Millicell细胞培养插入物，30mm，亲水性PTFE，0.4μm（Merck Millipore，目录号：PICM0RG50）
一次性移液器（SARSTEDT，目录号：86.1172.001）
5ml Sigma-Aldrich一次性血清移液管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4051）
50ml Falcon管
无菌24孔板

材料和试剂

Millicell细胞培养插入物，30mm，亲水性PTFE，0.4μm（Merck Millipore，目录号：PICM0RG50）
一次性移液器（SARSTEDT，目录号：86.1172.001）
5ml Sigma-Aldrich一次性血清移液管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4051）
50ml Falcon管
无菌24孔板

材料和试剂

Millicell细胞培养插入物，30mm，亲水性PTFE，0.4μm（Merck Millipore，目录号：PICM0RG50）
一次性移液器（SARSTEDT，目录号：86.1172.001）
5ml Sigma-Aldrich一次性血清移液管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4051）
50ml Falcon管
无菌24孔板
（Merck Millipore，目录号：106586）
NaH 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S-0751）
NaOH（Merck Millipore，目录号：106498）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
DMEM/F12培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21041-025）
胎牛血清（FBS）（Merck Millipore，Biochrom，目录号：S0115）
1×glutamax（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050-038）
N-2补充物（100x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17502-048）
Neurobasal培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12348-017）
B-27补充（50x）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17504-044）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Leibovitz的L-15 /青霉素 - 链霉素培养基（参见Recipes）
在Leibovitz's L-15中的3％SeaPlaque琼脂糖（参见Recipes）
10x磷酸盐缓冲溶液（PBS）（见配方）
10 M NaOH（见配方）
具有100单位/ml青霉素 - 链霉素的无菌1x PBS（0.1M PBS）（参见Recipes）
25％葡萄糖的1x PBS（见配方）
DMEM/F12加培养基（见配方）
Neurobasal/B-27加培养基（见配方）
4％多聚甲醛（PFA）（参见配方）

设备

37℃，5％CO 2强制空气培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：3110）中。
解剖显微镜（Leica Microsystems，型号：MZ125）
2 Dumont＃5镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-10）
Moria穿孔勺（Fine Science Tools，目录号：10370-17）
250ml玻璃烧杯
二合一微铲（Fine Science Tools，目录号：10091-12）
徕卡vibratome（VT 1000S）
镀镍针座（Fine Science Tools，目录号：26018-17）

注意：所有手术工具在使用前都应进行紫外线灭菌。

程序

所使用的住房和所有动物程序均根据欧盟政策（指令86/609/EEC）和经制度批准的方案。 E0.5：阴道栓塞的一天。

在妊娠的同一天用子宫颈脱位处死受体和供体基因型的怀孕小鼠。胚胎在胚胎14.5（E14.5）胚胎更容易处理
从其卵黄囊中取出胚胎，并使用Dumont＃5镊子在Leibovitz's L-15 /青霉素 - 链霉素培养基中在解剖显微镜下解剖它们的脑（视频1）。

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视频1.从小鼠E14.5胚胎脑清除。视频说明了从胚胎阶段E14.5的小鼠胚胎中分离脑的一步一步的说明。

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皮层和OB与中脑分离（视频1）。图1显示了皮层和OB以及移植部位的图示。我们在Leibovitz's/L-15（60℃）中的24孔板中加入2ml预热的3％SeaPlaque琼脂糖，孔板置于冰上。每个样品用如图2A所示的多孔勺子转移

图1.图示显示来自小鼠E14.5胚胎的前脑的顶视图和侧视图。移植区域以红色表示。
使用200μl移液管尖旋转液体，以防止样品接触孔底部（图2B）。优选地，在大约10-15分钟之后，在凝固之前，使用尖端在琼脂糖中设置样品的取向。在我们的情况下，嗅球是垂直向上的

图2.将组织包埋在冰上的Leibovitz's L-15中的3％SeaPlaque琼脂糖中。A.用穿孔勺子将解剖的脑转移到含有3％SeaPlaque琼脂糖的孔中的Leibovitz's L- 15。将具有琼脂糖的24孔板预先置于冰上。 B.使用200μl移液管尖旋转液体。在不破坏组织的情况下，使其在垂直位置上定向。旋转约10分钟，直到琼脂糖开始凝固
填充vibratome的坦克与冰冷的1×PBS与青霉素 - 链霉素。
使用新的紫外线消毒的vibratome刀片。
用微量刮刀从塑料孔中取出含有组织的琼脂糖块
用钢刀片切割琼脂糖块以形成梯形，其中组织水平放置在其中心（图3A）。
使用瞬间胶水，并将组织块固定到vibratome的金属标本板，梯形的大底朝下。
适应振动台上的标本板，设置速度为5，频率为5，进给为250μm。
使用穿孔勺子进行连续切割，并将含有嗅球的切片转移到含有2 ml Leibovitz's L-15 /青霉素 - 链霉素培养基的60 mm培养皿中（图3B）。
将具有正确方向的细胞培养插入物置于含有2.2ml DMEM/F12加培养基的新的60mm培养皿中。在膜的顶表面上加入100μl的DMEM/F12加培养基，如图3C所示
使用解剖钳从组织切片中移除周围的琼脂糖，并用无菌一次性移液管将其转移到细胞培养插入膜的顶部（图3D）。对受体和供体部分使用单独的膜
在37℃，5％CO 2孵育1小时
取出的培养皿，从培养箱中取出2毫升培养基，使用5毫升无菌一次性吸管从板。然后，向板中加入2ml预热（在37℃）Neurobasal/B27加培养基。膜的顶部的部分在整个程序期间保持湿润，并且它们的介质将通过与其接触的膜孔逐渐替换为新的。
在解剖显微镜下，使用直的三角形插针（适合于针座）在受体部分切开一个小三角形的OB，并用200μl移液管将其从切片上取下。
切割一个稍大一点的供体OB部分，并用接近受体部分的200μl移液管（在培养基中移植）转移它（图3E）。
将移植物（图3E中的红色*）推向接受者的缺失部分，并使用微型针（适合针型支架）进行调整（图3F）。
在37℃，5％CO 2孵育移植切片（图3F）24,48或72小时。每24小时更换一次培养基。

图3.步骤中的移植程序 A.准备梯形，其中组织水平放置在其中心。 B.包含前脑的矢状断面。 C.将细胞培养插入物施加在含有2.2ml DMEM/F12加培养基的60mm培养皿中。加入斑点100微升的DMEM/F12加培养基。 D.在细胞培养插入物的顶表面上的脑切片，干净的琼脂糖。 E.背侧OB的近端至皮层部分已经从接受者切片移除，并且来自供体的相同部位的稍大片被转移到接受者附近（红色星号）。 F.移植已经以正确的方向应用于受体切片。刻度：在D，E，F中为1mm
为了进一步切片，用4％PFA在室温下固定组织切片1小时，在1x PBS中洗涤，并将其转移至24孔板中的干净孔的底部。
干燥切片并如前所述将其重新嵌入3％的SeaPlaque琼脂糖中（切片现在应该留在孔底部）。
以类似于前面描述的方式在振动器中以50μm厚度重新切割组织
继续如Bastakis等人所述的免疫染色。（2015）。

代表数据

关于从来自GFP标记的小鼠（BrdU在E11.5脉冲）的背外侧OB的近端至外皮部分的投影神经元（Tbr1 ⁺）的迁移的预期结果的代表性图像，如下所示（图4，改编自Bastakis等人，2015）。

图4.来自小鼠脑切片的背部OB的移植用于迁移投影神经元的研究 A.如方案中所示，在矢状E14.5切片上产生移植物，其中供体细胞表达GFP或BrdU脉冲在E11.5。将WT GFP ，BrdU ⁺（在E11.5的BrdU注射）细胞移植到WT受体上，并对GFP和Tbr1（未成熟OB投影神经元的标记）进行免疫染色，或GFP和BrdU。迁移细胞（GFP ⁺）是投影神经元（与Tbr1，箭头，上图像共定位），出生于E11.5（与BrdU，箭头，下图像共定位）。切片的背部显示为B.比例：150μm。

食谱

Leibovitz's L-15 /青霉素 - 链霉素（50ml） 0.5ml 100x青霉素 - 链霉素 49.5ml Leibovitz's L-15
过滤灭菌（0.2μm）
存储在4°C
3％SeaPlaque琼脂糖在Leibovitz's L-15（10ml）中

使用高功率微波炉在50毫升Falcon管中加热10毫升Leibovitz's L-15培养基，直到气泡出现（即将煮沸前）。
注意：Falcon管应该放在装有100毫升水的250毫升烧杯中，杯应稍微松一些。
通过剧烈振荡将0.3g的SeaPlaque琼脂糖溶解在预热的培养基中。如果仍有未溶解的颗粒，如前所述再沸腾1分钟。
使用前将溶液在水浴中冷却至60°C

10x PBS（1升）
将70.1g的NaCl与2g的KCl，12.8g的Na 2 HPO 4，4.4g的NaH 2 PO 4
如果需要，用10M NaOH将pH调节至7.4 将dH <2> O添加到1升
过滤灭菌（0.2μm）
在RT存储
10 M NaOH
重量40克NaOH在烧杯中
加入dH ₂ O使溶液达到100ml/dm 2 在RT存储
1×PBS用100单位/ml青霉素 - 链霉素加入100毫升10x PBS的890毫升无菌水，并混合
加入10毫升100x青霉素 - 链霉素股票
混合和过滤除菌（0.2μm）
存储在4°C
25％葡萄糖的1x PBS（50ml）中将12.5g葡萄糖溶于30ml 1x PBS中
向50 ml
中加入1 x PBS 过滤灭菌（0.2μm）
存储在4°C
DMEM/F12加（25ml） 0.6ml 25％葡萄糖 1.25 ml FBS
0.25ml 100×青霉素 - 链霉素 0.25ml 100x glutamax
0.25ml N2补充剂
22.4ml DMEM/F12
过滤灭菌（0.2μm）
存储在4°C
Neurobasal/B27加（50ml） 1.2ml 25％葡萄糖 0.5ml 100x青霉素 - 链霉素 0.5ml 100x glutamax
1 ml B27补充剂
47.75 ml neurobasal
过滤灭菌（0.2μm）
存储在4°C
4％多聚甲醛（PFA）在1×PBS中将4g PFA溶解在装有100ml预热的1×PBS（在65℃）的瓶子中
加入20μl10 M NaOH，混匀，直至溶液澄清
用0.45μm过滤器过滤并在4℃保存1周或在-20℃保存几个月。

致谢

此协议改编自以前发表的研究，de Diego等人。（2002），由Bastakis等人进行。（2015）。这项工作得到了欧盟委员会FP7项目"转换潜力"[合同编号285948]，InnovCrete [316223]，ARISTEIA I [项目593 MyelinTag]和分子生物学和生物技术研究所的授权。

参考文献

Bastakis，GG，Savvaki，M.，Stamatakis，A.，Vidaki，M.和Karagogeos，D。（2015）。对尾骨髓质前脑神经元迁移的多种影响。 129（2）：297-306。