材料和试剂

60×15mm无菌培养皿（Corning，Falcon ，目录号：353002）
微透镜管
吸头提示
白色聚苯乙烯平底96孔板（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-566-619）
PVDF（聚偏二氟乙烯）Western蛋白质印迹膜（Sigma-Aldrich，Amersham Hybond ^{TM，目录号：GE10600023）}
透明粘合片膜（USA-Scientific，目录号：2921-7810）
X-射线胶片（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：34091）
表达来自转基因或来自内源基因座的感兴趣的蛋白质的植物系
环己酰亚胺（CHX）（Sigma-Aldrich，目录号：C1988）
第一抗体[实施例，抗HA-HRP（3F10）（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：12158167001）]
二抗（辣根过氧化物酶连接）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1662408EDU）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
漂白剂（次氯酸钠）（VWR International，Chlorox ，目录号：89501-620）或来自杂货店或药店如Chlorox漂白剂。
含有微量营养素的Murashige和Skoog基础盐（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）
蔗糖
MES [2-（N-吗啉代）乙磺酸]游离酸（Merck Millipore，Calbiochem ，目录号：475893）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126）
硫胺-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T4625）
吡咯啶-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9755）
肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I1525）
氢氧化钾（KOH）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：P250）
Bacto琼脂（BD，Difco，目录号：214010）
Parafilm（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：13-374-10）
液氮
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
乙二胺四乙酸（EDTA），脱水二钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S311）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377）
氯化镁六水合物（MgCl 2）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：M33）
BSA（牛血清白蛋白）用于蛋白质标准曲线（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A2383）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
IGEPAL CA-630 [辛基苯氧基聚（乙烯氧基）乙醇]（Sigma-Aldrich，目录号：I8896），Nonidet P-40的非离子非变性洗涤剂替代品
MG132（苄氧基羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸）（Peptides International，目录号：IZL-3175-v）
完全微型蛋白酶抑制剂EDTA-游离片剂（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：4693159001）
蛋白浓度测定（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
化学发光免疫印迹开发试剂盒（SuperSignal West Pico或Dura扩展持续时间底物）（Thermo Fisher Scientific，目录号：34077和34075）
D-荧光素钾盐（Gold Biotechnology，目录号：LUCK-100）
生长培养基（GM）（参见食谱）
萤光素酶提取缓冲液（参见配方）
荧光素酶测定缓冲液（参见配方）
用于Western印迹测定的蛋白质提取缓冲液（参见配方）

设备

用于蛋白质测定测定的平板读数分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
冷冻离心机（Eppendorf）
SDS-PAGE凝胶装置和电源（Thermo Fisher Scientific）
用于蛋白质提取的瓷研钵和杵（Thermo Fisher Scientific）
Western转移装置（Thermo Fisher Scientific）
读板光度计（Berthold Technologies）
平板扫描仪（Hewlett-Packard）
X射线胶片显影器，一组水箱或托盘，或自动机器
用于Western印迹孵育的孵育摇床（Thermo Fisher Scientific）

软件

Excel和另一个统计包如GraphPad Prism或Stata
NIH ImageJ 1.36（ http://rsb.info.nih.gov/ij/）
ImageQuant 1.0软件（ http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-us/products/AlternativeProductStructure_16016/29000605 ）

程序

合并的幼苗放线菌酮体内降解方案（参见注释）
该方案称为合并苗降解测定，因为幼苗群体在多个培养皿中生长，并且在添加蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）后在特定时间收获的一个平板的提取物测量的蛋白质/活性表示单个时间点（参见图1，顶部）。强调的该测定的一个重要方面是降解在体内发生，并且在降解，蛋白质提取和检测终止后测定在特定时间点保留的蛋白质的量。 CHX是完整幼苗的有效蛋白质合成抑制剂（Ramos等人，2001）。可以测量任何蛋白质的降解速率和随后的半衰期，并从汇集的苗CHX测定中获得的数据导出，只要存在通过酶测定或抗体检测检测蛋白质的能力即可。在每个时间点的多个板可以包括在分析中，并且相同的提取物（时间点）被多次取样。最后，应该用独立生长的幼苗重复实验。

图1.使用LUC融合物分析的合并幼苗测定的程序。对于Western分析，初始程序是相同的，但通过SDS-PAGE和Western筛选用选择的抗体分析提取物，而不是等分到微孔板并在发光计中分析

将〜2mg拟南芥种子（称出）置于微量离心管中，并用300μl30％商业的新鲜（小于2周龄）溶液通过10分钟处理进行表面灭菌漂白+ 0.1％Tween-20，然后用2次无菌水冲洗（通常为800μl）以除去漂白剂。然后将种子悬浮在1ml液体生长培养基（GM）中，并用移液管尖端转移至60×15mm密封（Parafilm）培养皿中，其尖端被切割以使开口更宽。种子在培养皿边缘周围小心扰动。种子和液体不应覆盖板的整个底部（图1，顶部）。这减少了对多余介质的需要。在电镀后，通过在4℃下在黑暗中孵育2-3天将种子分层。然后从冷却中取出平板，并在22℃下在恒定光（〜50-70μmol·sec -1 -1m -1 s -1）下温育6天而不摇动。该量的液体足够持续6天用于该量的种子。如果生长更坚固或使用更多的种子，则可能需要在第6天之前将培养基加入板中以保持幼苗充分水化。在无菌罩中，打开板并加入少量无菌液体GM介质。重新密封，在恒定光照下返回到22°C

在第6天的晚上，打开板，除去任何剩余的液体，并用900μl新鲜的无菌GM替换培养基。用新鲜的石蜡膜密封板。该步骤以及降解实验的开始，应该在一天的相同时间进行，以控制对降解的昼夜节律影响。

在第7天的上午，加入100μl的2,000μg/ml环己酰亚胺（CHX）储备液（CHX粉末溶解于液体GM培养基中。储存液应当小于2周龄储存在4 ℃），并在相同条件下孵育至少三个时间段：例如 - 15,30和45分钟（对于非常短暂的蛋白质）或1,2和4小时（对于更稳定的蛋白质）。要在添加的CHX中混合，用圆形运动在手中摇动平板15秒。在时间过程中再次与手混合。也可以使用中间时间（见注1和2）。减CHX对照（模拟样品）由通过加入100μlGM单独处理最长时间的幼苗盘表示。我们建议在实验的每个时间点模拟3个平板（生物复制）。在我们手中，在对照孵育中的蛋白质水平与在时间过程开始时收获的样品没有不同。

适当的时间后，从板上移除幼苗，用Kimwipe或纸巾吸干，并在液氮中快速冷冻。在获得所有样品后，应尽可能快地处理它们。

当准备好处理样品时（在我们的手中，在-80℃下储存组织用于LUC测定超过几天导致可变的活性，并且因此组织应当在收集后不久被处理），在〜200 μl荧光素酶提取缓冲液，如果通过荧光素酶测定定量目的蛋白质，或者在〜200μl蛋白质提取缓冲液中，如果通过Western印迹定量蛋白质。

通过在冷冻离心机（4℃）中以15,000×g离心20分钟来清除样品，并将上清液转移到在冰上预冷的干净管中。使用Bradford测定或等效方法定量每个样品中的蛋白质浓度。
注意：对于方案的其余部分，遵循荧光素酶测定或蛋白质印迹测定的适当指导。 [荧光素酶测定（见图1，方案大纲，包括荧光素酶测定）]

将每份样品的10μl提取物转移到白色的聚苯乙烯平底96孔板的孔中。将样品排列在平板上，以便可以一式三份或至少一式两份进行测量。

编程光度计注入100微升荧光素酶测定缓冲液到每个孔，然后40微升0.5毫米荧光素（加载到一个注射器水库）。测量发光（相对光单位，RLU）8秒。设置程序注入缓冲液，然后荧光素，立即测量。每个发光计具有设置用于注射溶液（在这种情况下应为荧光素）和用于收集光发射的时间长度的程序。请阅读您的特定品牌和型号随附的说明

通过使用来自发光计的数据和每个样品的蛋白质定量测定计算RLU /μg蛋白质

平均模拟样品的RLU /μg蛋白质，并用其在其他时间点标准化RLU /μg蛋白质。

通过计算归一化RLU /μg蛋白的自然对数（ln）来线性化数据。

绘制归一化RLU /μg蛋白质的自然对数（ln）对时间，平均模拟样品作为0时间点，并进行线性回归以确定该线的斜率。我们通常迫使线通过原点。将ln（0.5）除以斜率以确定半衰期。我们建议每个时间点有3个生物学重复，每个生物学重复有3个技术重复。线性回归表示对于单个实验组合的所有这些重复。样品数据图见图2。
注意：蛋白质印迹测定（如上所述进行1-6，然后继续7）。参见图3，用于Western印迹分析的样品数据

图2.来自使用LUC融合体的合并幼苗降解测定的样品数据。使用如文中所述和图1所示的方案分析3个不同的转基因品系。两条线在两种不同的拟南芥Col-0遗传背景中表达IAA1：LUC融合;野生型（洋红色线）和 cul1-7 （蓝色线）。如在图中所示的文本和回归线中所述分析数据。野生型系中IAA1-LUC的半衰期为14分钟，并且在cul1-7中的半衰期为〜70分钟。表达未融合的荧光素酶的转基因品系在该时间期间没有显示可检测的降解（黄线）。根据在Gilkerson等人获得的数据进行改编。（2007）。

蛋白质定量后，将每个时间点的等量总蛋白质加载到用于SDS-PAGE的标准聚丙烯酰胺凝胶上。施加到凝胶上的总蛋白的量取决于蛋白质的丰度，其必须根据经验确定。将蛋白质从凝胶转移到PDVF膜用于抗体可视化。使用抗体的蛋白质可视化的确切条件取决于抗体和蛋白质的表达。例如，有多个具有不同灵敏度的化学发光检测试剂盒

当使用胶片时，应使用平板扫描仪扫描印迹，而不进行自动调节，并保存为8位灰度标记图像文件格式图像。扫描和捕获图像后，使用NIH ImageJ 1.36进行斑点光密度测量，无背景校正，以量化每个时间点的蛋白质量。有关使用ImageJ进行斑点光密度测量的详细说明，我们推荐网站"使用ImageJ分析凝胶和西部"（ http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots- with-image-j/）。

将不同时间的蛋白质量归一化至无CHX的量。计算归一化值的自然对数以线性化数据。应该相对于时间绘制ln（归一化带强度），并且该线的斜率用于通过以下等式计算半衰期：t 1/2 = [ln（0.5）] /坡。所有印迹的数据应该组合以绘制一条线用于最终半衰期计算。应进行线性回归分析以计算线的斜率的95％置信区间

该实验应重复至少3次，每个样品分析两次作为技术重复。参见图3的样品蛋白质印迹分析。

图3.使用蛋白质印迹分析的混合幼苗降解测定的实施例在2种不同的遗传背景，野生型（CULLIN 1）和cry1中评估天然植物色素A（PhyA）的稳定性-7 ，缺陷型泛素E3连接酶。种子在1ml液体GM中发芽，黑暗生长4天（以允许PhyA积累）。加入环己酰亚胺（除了暗模拟对照外），并将幼苗暴露于20μmol/m 2 --s的sup-1红光，持续指定的时间，然后闪烁冻结。 PhyA在光中降解。制备蛋白质提取物，通过SDS-PAGE分离40μg总蛋白。通过用抗（α）-PhyA抗体的免疫印迹测定不同时间的PhyA水平。包括交叉反应性带作为加样对照。 B.在cul1-7中对PhyA降解的定量。 ImageQuant 1.0软件用于定量来自（A）中所述的Western印迹分析的相对PhyA水平。数值表示来自三次独立实验的总共至少三次Western印迹的平均值±SD。 PhyA在cul1-7中不会明显降解。这是来自Gilkerson等人的图7。（2009）。转载获得美国遗传学会的许可，它拥有版权

使用萤光素酶（LUC）融合的单苗CHX in in vivo 降解测定
该方案被称为单苗降解测定，因为在个别幼苗中分别测量LUC融合蛋白的降解，并且之后汇集各个降解动力学以获得单一半衰期。在我们的实验室，已使用此协议分析的唯一的蛋白质已表示为与报告蛋白荧光素酶（通常来自萤火虫）融合的蛋白质。因为荧光素酶底物是细胞可渗透的，所以在与荧光素孵育后，可以在完整幼苗中检测荧光素酶活性作为光发射，并且可以在发光计中对所发射的光进行定量（Gilkerson等人，2009 ）。在植物中，当提供完整植物时，未融合的LUC的半衰期被确定为约70分钟，底物荧光素并且体内降解测量（Gilkerson等人， 2009）。因此，在这些体内实验中，蛋白（肽）-LUC融合蛋白的半衰期必须短于70分钟，否则所测定的降解速率将主要由荧光素酶部分融合蛋白。但是，如果蛋白质降解（肽）-LUC融合比70分钟更快，则观察到降解速率由存在于与LUC共表达的蛋白质（肽）中的降解决定子产生，而不是简单地从LUC氨基酸单独。 />

来自表达LUC融合体的植物的种子被表面灭菌（步骤A1），并在4℃在黑暗中在水中吸收2天。将单个种子置于含有200μl固体GM培养基的白色，聚苯乙烯，平底96孔板的一个微量滴定孔中。板用透明的粘性板膜密封并在室温下连续白光照射7-10天（图4）。

图4.在每个孔中具有一个拟南芥苗的96孔微量滴定板的近视图。体内 LUC活性可以在添加底物荧光素后的发光计
孵育后，向每个孔中加入50μl的1mM荧光素，并将板在黑暗中（用箔覆盖）在室温下缓慢摇动孵育60分钟。然后向每个孔中加入20μl的2,000μg/ml CHX溶液，并将板立即放入发光计进行测量。在时间过程中监测光发射，每15分钟进行一次测量
光度计测量（在此建议在每个时间点测量8秒）从单个幼苗发出的相对光单位（RLU），并且将数据存储在Excel电子表格中。
数据分析。每次记录之间的时间间隔由第一次测量开始时指定的时间0的分钟数确定。在每个时间点的RLU（相对光单位）是归一化到零时间点测量。为了线性化数据，对于每个单独的幼苗计算ln（归一化RLU）。使用Excel中的斜率函数计算每个幼苗的降解线的斜率。使用以下公式计算半衰期：半衰期（min）= ln（0.5）/斜率。平均所有幼苗的半衰期并确定描述性统计（标准偏差，标准误差，95％置信度）。有关示例数据，请参见图5

图5.来自单苗降解测定的样品数据 A.通过单苗测定在240个个体中测定IAA7-LUC半衰期的频率分布。 B.AIA7-LUC的半衰期为15.0分钟，使用（A）中所示的单苗测定数据测定。误差棒是标准偏差。

笔记

如果没有目标蛋白质的降解动力学的先验知识，我们建议在一个处理时间点的中试实验，以确定蛋白质是否快速降解（半衰期小于1小时）或更慢，半衰期> 1小时。对于这些中试实验，方案是相同的，除了仅需要2个板，一个仅添加溶剂 - 没有环己酰亚胺（CHX）和一个添加CHX。我们建议从2小时CHX治疗开始。如果蛋白质在2小时后完全不存在（基于正常样品处理和信号发展时间，在+ CHX样品中），则需要短时间过程。如果蛋白质丰度只有略微降低，然后需要在1小时后和1小时后开始的更长时间过程，例如1小时，2小时和4小时的CHX处理。如果检测到蛋白质水平，但在2小时（<50％）显着降低，则在30分钟，1和2小时范围内的时间过程是适当的。可以重复该单一时间点CHX测定，直到观察到适当范围的蛋白质损失。
为了测量蛋白质半衰期，一旦确定适当的时间，需要多个时间点 - 此外，其至少一个时间点中的其控制值的50％。考虑到可能发生复杂的降解动力学，线的外推以计算半衰期是不合适的;因此，如果用于产生该系的值来自蛋白质，则不能通过推断经过最后时间点的线来达到初始值的50％，或通过使用衰变方程来确定半衰期，不能精确测量蛋白质半衰期在时间过程中没有显着减少
我们还建议使用快速降解的蛋白质作为对照蛋白，以监测CHX的功效并验证程序和时间进程。在每个实验中，我们常规地包括表达可检测形式的拟南芥蛋白质吲哚乙酸1（IAA1）的转基因品系的样品，因为该蛋白质是非常短暂的，半衰期为〜12 -15分钟（Ramos等人，2001; Zenser等人，2001）。表达3xHA-IAA1（Dreher等人，2006）或IAA1-LUC融合体（Zenser等人，2001; Dreher等人， em。，2006）。观察到该蛋白在短时间内显着损失，在较长时间（<1小时，在特定条件下）检测不到的量，并且可以证明CHX处理在阻断新合成中是有效的。这样的转基因品系可根据要求从相应的作者获得。
CHX测定法也使用相同的培养皿使用相同的合并幼苗测定（在这种情况下更准确的术语将是合并叶盘测定）与漂浮在GM培养基上的成熟叶盘一起工作（但是预孵育2-4小时后置于GM）。将叶盘（或冲头）放置在GM培养基上，允许在测定条件下温育2-4小时，然后如步骤A3中添加CHX（或模拟物）。
上述两种实验方法利用放线菌酮进入完整器官/幼苗的细胞的能力并有效抑制蛋白质合成的能力，这是长期以来已知的性质[例如参见（Delseny等人 > 1977，Sluiters-Scholtern，1973）]。一句谨慎。用放线菌酮治疗相当长的时间可能导致副作用。如果您的蛋白质具有适度的降解速率，基于这些CHX测定的小时数，强烈建议不同的方法确认半衰期，给定在蛋白质合成抑制剂中长时间孵育的可能的次级影响。例如，蛋白质的降解可以取决于在长CHX追踪测定期间将被耗尽的短寿命蛋白质。在这种情况下，蛋白质将在CHX测定中显示稳定，而在体内它可能是短暂的。蛋白质的降解可以与正在进行的合成偶联，其用CHX处理阻断。 RNA合成受CHX影响，一些基因被放线菌酮诱导（可能由于短寿命抑制因子的调节），虽然不太可能，这些影响可以调节您的蛋白的寿命。替代方法是脉冲追踪实验（具有放射性标记的氨基酸，但没有CHX），15 N和D 2 O标记实验（Yang等人，/2010>，2010; Li 。，2012）。有关该主题的概述，请参阅最近的评论（Nelson和Millar，2015）。

食谱

生长培养基（GM）
4.3 g/L Murashige和Skoog基础盐与微量营养素
1％蔗糖（虽然可能植物细胞培养等级不是必需的;其他来源可能是等同的） 2.5mM MES游离酸
1×B维生素（来自以下4种在水中的混合物的100×储备液，过滤灭菌，在4℃下储存），包含以下4个项目：
0.5μg/ml烟酸
1.0μg/ml硫胺素-HCl 0.5μg/ml pyroxidine-HCl
0.1μg/ml肌醇-6 用1M KOH将pH调节至5.7 添加8g/L Bacto琼脂用于固体GM; 省略液体GM
萤光素酶提取缓冲液
100mM磷酸钾缓冲液，pH 7.8
1mM EDTA，脱水二钠
7 mMβ-巯基乙醇 1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）
完全蛋白酶抑制剂片，1片/10ml缓冲液
萤光素酶测定缓冲液
25mM三羟甲基氨基甲烷（tricine），pH7.8，用HCl调节pH
15mM MgCl 2·h/v 7 mMβ-巯基乙醇 1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）
5 mM ATP
用于Western印迹测定的蛋白提取缓冲液
50mM Tris，pH7.2，用HCl调节pH
150mM NaCl 0.5％（v/v）IGEPAL CA-630
1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）
10μMMG132
完全迷你蛋白酶抑制剂无EDTA片，1片/10ml缓冲液

致谢

这些方案从先前公开的材料和方法（Gilkerson等人，2009; Dreher等人，2006; Gilkerson和Callis，2014; Gilkerson > et al 。，2015）。这项工作由NSF（MCB-099100）和DOE（DE-FG02-12ER16077和DE-SC0002175）支持。

参考文献

Dreher，KA，Brown，J.，Saw，RE和Callis，J.（2006）。拟南芥 Aux/IAA蛋白家族在降解和生长素反应性方面有多样性。植物细胞）：699-714。

Delseny，M.，Aspart，L.and Guitton，Y。（1977）。蛋白合成抑制剂放线菌酮对萝卜幼苗中RNA合成的影响。生物化学59（1）：51-57。

Gilkerson，J.，Hu，JH，Brown，J.，Jones，A.，Sun，TP和Callis，J.（2009）。 CULLIN1的隐性等位基因，其破坏CUL1的C末端的SCF功能拟南芥。 181（3）：945-963。

Gilkerson，J.和Callis，J.（2014）。在拟南芥中IAA1-LUC降解突变体缺失的突变体的遗传筛选揭示了TOPOISOMERASE6B在植物生理生理学中的重要需求。植物信号分析9（10）：e972207。

Gilkerson，J.，Kelley，DR，Tam，R.，Estelle，M.和Callis，J.（2015）。赖氨酸残基不是蛋白酶体介导的植物生长素/吲哚酸性酸性蛋白IAA1蛋白水解所必需的。植物生理学168 2）：708-720

Li，L.，Nelson，CJ，Solheim，C.，Whelan，J.and Millar，AH（2012）。使用二维凝胶分离的蛋白点的渐进15N标记的动力学确定拟南芥蛋白的降解和合成速率。 Mol Cell Proteomics 11（6）：M111 010025.

Nelson，CJ和Millar，AH（2015）。蛋白质植物生物学周转。自然植物 1（3）。

Ramos，JA，Zenser，N.，Leyser，O.和Callis，J.（2001）。使用氧化氘测量拟南芥蛋白质的转换率：生长素信号传导案例研究植物J em> 63（4）：680-695。

Zenser，N.，Ellsmore，A.，Leasure，C.and Callis，J.（2001）。 Auxin调节Aux/IAA蛋白的降解速率。 Proc Natl Acad Sci USA 98（20）：11795-11800。 >