材料和试剂

圆形（90mm直径）或方形（120×120mm）培养皿
可高压灭菌的过滤材料[例如，Miracloth（Merck Millipore，目录号：475855）]
Calcofluor白色荧光增白剂（Sigma-Aldrich，目录号：F-3543）
刚果红（Sigma-Aldrich，目录号：860956）
蒸馏水
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：P5958）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
土豆
布过滤器
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（Scharlab，目录号：01-483-500）
酵母提取物（Merck Millipore，目录号：1119261000）
蛋白胨（Merck Millipore，目录号：1119311000）
葡萄糖（VWR，Normapur ^®，目录号：50-99-7）
琼脂（BD，Bacto ^TM，目录号：214010）
MgSO 4·7H 2 O（Merck Millipore，目录号：1058865000）
（Merck Millipore，目录号：1048731000）
KCl（Merck Millipore，目录号：1049330500）
NaNO 3（Merck Millipore，目录号：1065371000）
蔗糖（Merck Millipore，目录号：1076875000）
琼脂（Thermo Fisher Scientific，Oxoid ^TM，目录号：LP0011）
2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：69892）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（见配方）
CFW和CR储备溶液（见配方）
1. CFW储备溶液（20mg/ml）
2. CR储备溶液（50mg/ml）
真菌生长琼脂培养基（见Recipes）

YPD琼脂培养基
PDA琼脂培养基
Puhalla的最小琼脂培养基（MM）

注意：CFW和CR是危险的，可能致癌，因此必须小心避免皮肤接触或吸入这些化合物。

设备

保护手套和外套
用于制备溶液的烧瓶和磁力搅拌器
用于细胞计数的Neubauer室
微波
高压灭菌器
真菌生长孵化器
水浴
层流罩
加热板和蒸煮锅煮土豆
pH计

注意：不需要其他特殊设备。

软件

SPSS 15.0 for Windows ^®（LEAD Technologies Inc.）

程序

该方案的主要要求是实验确定要使用的CFW或CR的最佳浓度。这可能受几个参数影响，包括接种物的大小，菌株的遗传背景和生长培养基的组成。在我们的实验室中使用的野生型菌株是尖镰孢（Fusarium oxysporum）f.sp。（菌株4287/FGSC 9935）。对于实验中使用的野生型或参照菌株，适当的CFW和CR浓度应是亚致死的。我们通常通过以板上斑点的形式接种连续稀释的分生孢子来定义该参数含有CFW和CR，浓度范围为10-200μg/ml CFW和5-600μg/ml CR。

生产新鲜微小分生孢子（3-4天）
接种50μl的-80°C股票微锥体悬浮液（在30％甘油）到50ml液体马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（见配方1）。在28℃下以170rpm振荡生长培养物3-4天（Di Pietro和Roncero，1998）。通过一层Miracloth过滤小分生孢子，离心并用无菌水洗涤。使用neubauer室计数分生孢子并调整至1×10 7分生孢子/ml的终浓度。
制备CFW（20mg/ml）和CR（50mg/ml）（1小时）的储备溶液（见配方2）
生长培养基的制备（1-2小时）
准备生长琼脂培养基和高压釜（在120℃下20分钟）。在加入CR和CFW之前，将介质在水浴中冷却至50-60℃，以避免任何潜在的危害烟雾。然后，添加CFW或CR以达到所需的浓度。这可以在层流罩中进行。对于 F。我们建议从以下范围内测试4-5种不同的染料浓度开始：CFW为10至200μg/ml，CR为10至600μg/ml。另外，制备没有染料的对照板。板可以储存过夜，在室温和在黑暗中，第二天使用。
制备微小分生孢子的连续稀释液（1-2小时）
制备新鲜获得的小分生孢子的10倍系列稀释液，从步骤1中产生的1×10 7个分生孢子/ml储液开始（1×10 7个，1× 10×10 6个，1×10 5个和1×10 4个分生孢子/ml）。将2μl该系列滴在含有CFW或CR的板上和对照板（终浓度：2×10 4，2×10 3，2×10 6， 2×2和2×10 5分生孢子/ml）。我们通常使用方形（120×120mm）培养皿，以便有足够的空间用于真菌菌落的生长。
平板培养（2-3天）
在28℃下在黑暗中培养平板2-3天
解释和监测结果
1. 对CFW和CR的敏感性应通过比较对照和CFW或CR板中亲本和突变菌株的集落形成的程度来确定。可以测量菌落直径以定量测试的菌株的菌落生长的差异。为此，在对照和细胞壁应激平板上接种每个单个菌株（5μl的1×10 7个微孔/ml悬浮液滴），每个重复5次。我们使用圆形（90mm直径）培养皿。孵育板在28℃下5天，然后扫描和测量菌落直径
2. 然后可以使用统计软件（例如用于Windows 的SPSS 15.0）分析来自三次独立实验的数据，每次实验重复五次。使用Kruskal-Wallis方差分析（ANOVA）和Mann-Whitney检验在P ≤0.05时评估菌株之间的统计学相关差异。

代表数据

图1示出了几个F的灵敏度。尖孢镰孢MAPK通路突变体对CFW和CR的影响（Perez-Nadales和Di Pietro，2011）。在 F。尖孢镰孢，Fmk1 MAPK途径对于植物感染是必需的（Di Pietro等人，2001）。该实验揭示了在Fm中细胞壁完整性需要Msb2（一种在Fmk1上游起作用的信号转导粘蛋白受体以及Fmk1 MAPK）。 oxysporum 在这些条件下。

图1.F的细胞壁应力测定。 A.含有YPD培养基或补充有CR或CFW的YPD培养基的平板用指定的菌株和微量分生孢子点接种，在28℃温育3天并拍照。 B.在接种后第3天测量指定培养基的菌落直径，并相对于野生型菌株（100％）作图。误差棒表示从五个独立平板计算的标准偏差。根据Mann-Whitney检验，相同字母的值没有显着差异（ P <0.05）。

笔记

在处理过程中，CFW和CR解决方案应始终通过用铝箔包装容器来防止光照。作为防止可能的光灭活CFW和CR的预防措施，板应该在黑暗中孵育。

食谱

马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）
1. 将200g的剥皮马铃薯在1L蒸馏水中煮沸60分钟
2. 通过滤布过滤器
3. 加入20克葡萄糖，加入1升蒸馏水
4. 在120℃下高压灭菌20分钟灭菌
CFW和CR储备溶液
1. CFW储备溶液（20mg/ml）
  我们使用以下稀释解（Ram和Klis，2006）：
  20 mg/ml CFW
  0.5％（w/v）KOH
  83％（v/v）甘油注意：我们建议在实验前准备20-30ml的这种溶液，并储存在室温下。在实验当天，可以将CFW新鲜加入到该溶液中，达到20mg/ml的最终母液浓度。
2. CR储备溶液（50mg/ml）
  注意：CR是二钠形式，容易溶于水。
  在无菌双蒸水中制备CR，储备浓度为50mg/ml
注意：重要的是通过检查在温和混合后（即在旋转振荡器中）在储备溶液中没有可见染料粉末，确保CFW和CR完全溶解。
真菌生长琼脂培养基
用于这种细胞壁压力测试的生长培养基的组成可以根据实验的目的而变化。我们在我们的测定中使用完全培养基，例如YPD或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和Puhalla的基本培养基（Puhalla，1985）。所有培养基均在蒸馏水中制备。
1. YPD琼脂培养基
  3g/L酵母提取物
  10g/L蛋白胨
  20g/L葡萄糖 15g/L Bacto琼脂
2. PDA琼脂培养基
  3.9％PDA，w/v
3. Puhalla的最小琼脂培养基（MM）
  0.5g/L MgSO 4·7H 2 O·h/v 1g/L KH 2 PO 4 sub/
  0.5g/L KCl
  2g/L NaNO 3
  30 g/L蔗糖
  加入15g/L的类脂琼脂
注意：对于该测定，在高压灭菌（120℃下20分钟）之前将生长培养基缓冲至pH 5.5-7.0（Ram和Klis，2006）。为此，我们向生长培养基溶液中加入50 mM MES，并用NaOH调节至pH 6.5（可以预先制备10 N NaOH溶液，并缓慢加入MES缓冲的培养基中，直至达到所需的pH）。之后，我们加入琼脂（PDA除外），用蒸馏水将溶液加满至所需体积，并高压灭菌。

致谢

这项研究由SIGNALPATH Marie居里研究培训网络（MRTN-CT-2005-019277）和授权BIO2008-04479-E，EUI2009-03942和BIO2010-15505（来自西班牙部长会议）支持。

参考文献

Di Pietro，A。和Roncero，M.I。（1998）。克隆，表达和在编码主要细胞外基质的pg1的致病性中的作用内切多聚半乳糖醛酸酶的血清枯萎病原体尖孢镰孢。 Mol Plant Microbe Interact 11（2）：91-98。
Di Pietro，A.，Garcia-MacEira，F.I.，Meglecz，E。和Roncero，M.I。（2001）。血管枯萎病真菌的尖孢镰孢MAP激酶/em> 39（5）：1140-1152。
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Heilmann，C.J.，Sorgo，A.G.，Mohammadi，S.，Sosinska，G.J.，de Koster，C.G.，Brul，S.，de Koning，L.J.and Klis，F.M。表面应激在病原真菌中诱导保守的细胞壁应激反应em> Candida albicans 。 Eukaryot Cell 12（2）：254-264。
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Turra，D.，Segorbe，D。和Di Pietro，A。（2014）。植物致病真菌中的蛋白激酶：感染的保守调节剂。/a> Annu Rev Phytopathol 52：267-288