材料和试剂

35 mm细胞培养皿/孔
带有细胞过滤帽的流式细胞仪管（Corning，目录号：352235）
15 ml锥形管
35μm过滤器
FACS管
玻璃幻灯片
圆盖玻片（12mm＃1圆形）（VWR International，目录号：101415-528）
感兴趣的细胞系
注意：对于该方案，我们利用A498透明细胞肾细胞癌细胞系（ATCC，目录号：A-498），但是该方法可以容易地用其他细胞系进行。
油酸（OA）（100mg/ml，含10％BSA的DPBS溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：O3008）
将牛血清白蛋白（BSA）（在DPBS中10％，低内毒素，不含脂肪酸，适合于细胞培养，无菌过滤）（Sigma-Aldrich，目录号：A1595-50ML）
4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-不对称 - 引达省（BODIPY 493/503）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes< sup>，目录号：D3922）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：472301）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：10010031）
含有酚红的胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：25200-056）
HEPES
NaCl
CaCl 2
具有高葡萄糖和L-谷氨酰胺的Dulbecco改良的Eagle培养基（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：SH3024301）或适合于感兴趣的细胞系的其他培养基
胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-Products，Foundation ^TM，目录号：900-108）或适用于感兴趣的细胞系的其他FBS
注意：对于该方案，细胞在DMEM + 10％FBS中生长。
4％多聚甲醛（PFA）
具有4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：P36935）的Prolong Gold抗衰退试剂，
胶原I，大鼠尾（100mg）（Corning，目录号：354236）
2μMBODIPY染色溶液（见配方）
10x流式细胞仪缓冲液（见配方）
注意：也可以购买10x缓冲液[10x膜联蛋白结合缓冲液（BD，目录号：556454）]。

设备

钳子
配备有488mm激光器和用于测量FITC或GFP（，533/30）的过滤器组的流式细胞仪
注意：在本研究中，使用了BD Accuri C6仪器。

程序

BODIPY染色流式细胞术
1. 在与研究相关的培养条件下培养细胞。 35mm培养皿/孔对于该测定中所需的细胞数量是足够的。对于我们的测定，在35mm孔中50,000个A498细胞就足够了
  1. 用30μM油酸过夜温育细胞可以作为增加中性脂质含量的阳性对照，因为油酸是甘油三酯合成和储存的有效诱导剂。不含脂肪酸的BSA用作对照。
2. 在感兴趣的时间点，制备2μMBODIPY染色溶液的PBS。每个样品所需的染色溶液的体积对应于用于培养细胞的培养基的体积。
3. 使用3ml PBS快速冲洗细胞以去除培养基/血清。
4. 孵育在BODIPY染色溶液在黑暗中15分钟，在37℃。包括流式细胞术的未染色对照。
  注意：从这一点，尽可能地保护样品免受光。
5. 用3ml PBS快速冲洗细胞以去除染色溶液。
6. 胰蛋白酶化细胞以产生单细胞悬浮液。对于本方案中使用的A498细胞系，将细胞与胰蛋白酶-EDTA（0.25％）在37℃孵育5分钟。
7. 加入5毫升PBS，并将细胞悬浮液转移到15毫升锥形管。
8. 丸粒细胞在250×g下，5分钟，4℃。
9. 吸出上清液，使用3ml PBS快速冲洗细胞沉淀，并在250×g，5分钟，4℃沉淀细胞。
10. 小心吸出上清液，并悬浮细胞在300μl1x流式细胞仪缓冲液。
11. 将细胞悬液通过35μm过滤器进入FACS管。
12. 执行流式细胞术。每个条件最少获得10,000个事件。
13. 研究者可以将数据分析为平均荧光（图1A）或将数据显示为直方图（图1B）。
BODIPY染色显微镜
1. 高压灭菌在一个玻璃瓶的盖玻片。
2. 在组织培养罩，将盖玻片放入35毫米细胞培养皿。
3. 准备在PBS中的2mg/ml胶原溶液。
4. 用胶原处理盖玻片以促进细胞粘附。加入3毫升胶原溶液到培养皿中，在37℃孵育30分钟注意：使用镊子确保盖玻片与培养皿底部齐平，消除盖玻片下可能有的气泡。
5. 吸出胶原溶液。
6. 用PBS洗涤。
7. 向培养皿中加入PBS，并置于UV灯下的培养罩中灭菌。
8. 平板细胞到含有盖玻片的培养皿中。在染色时应确定最佳细胞数目以达到30-50％的汇合，以允许适当的成像。对于在该方案中使用的A498细胞，将100,000个细胞接种在35mm孔中，以允许在接种后48小时染色。
9. 在与您的实验相关的培养条件下孵育。
  1. 对于该方案，将A498细胞在补充有10％FBS的DMEM（高葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠）中在37℃温育。
  2. 用30μM油酸与BSA一起温育细胞可以作为增加中性脂质含量的阳性对照，因为油酸是甘油三酯合成和储存的有效诱导剂。不含脂肪酸的BSA用作对照。
10. 在感兴趣的时间点，在PBS中制备2μMBODIPY染色溶液。
  1. 对于该方案，在与BSA或BSA +油酸孵育过夜后，在铺板后48小时染色A498细胞。
11. 用3ml PBS洗涤细胞。
12. 在37℃下在3ml染色溶液上孵育15分钟注意：从这一点，尽可能地保护样品免受光。
13. 在3ml PBS中洗涤两次。
14. 修复细胞在3毫升4％PFA在室温下30分钟。
15. 去除4％PFA。
16. 在PBS中洗涤样品3×5分钟。
17. 使用镊子将盖玻片安装到载玻片上。
  1. 在玻片上加入一滴Prolong ^？金抗Dade试剂。
  2. 使用镊子拿起盖玻片并放置在安装溶液滴上，确保带有细胞的一侧面朝下放置在安装溶液上。
18. 让安装溶液在室温下固化过夜。
19. 载玻片可以储存在4°C或立即成像（图1C）。
  
  图1.细胞内中性LD的定量和可视化。 A。 A498细胞在BSA（0.2％）或30μM油酸与BSA的存在下生长过夜。根据标题为"BODIPY染色用于流式细胞术"的部分分析细胞。对于每个样品，将平均FL-1面积归一化为BSA处理的样品的平均FL-1面积。注意，油酸增加FL-1面积。 P - 值由非配对学生的测试决定。 *** P 0.001）。 B.（A）中描述的细胞的代表性直方图。 C.将生长在盖玻片上的A498细胞用BSA（0.2％）或30μM油酸与BSA处理过夜。根据标题为"BODIPY染色用于显微镜"的章节分析细胞。比例尺=5μm。

食谱

2μMBODIPY染色溶液
1. 准备5 mM BODIPY储备液
  将1.3mg BODIPY溶解于1ml DMSO中，并可储存于-20℃。
2. 2μMBODIPY染色溶液可以通过在PBS中稀释储备溶液1:2,500来制备。
10x流式细胞仪缓冲液
0.1 M HEPES（pH 7.4）
1.4 M NaCl
25mM CaCl 2。注意：
1. 10x缓冲液可储存于4°C。
2. 使用MilliQ水稀释至1x。

致谢

这项工作得到了NIH授予2-P01-CA104838到M.C.S和NIH授权5-F30-CA177106到B.Q.

参考文献

Green，AS，Coleman，RA，Kraemer，FB，McManaman，JL，Obin，MS，Puri，V.，Yan，QW，Miyoshi，H.and Mashek，DG（2011）脂滴在啮齿动物和人的代谢疾病中的作用。 Clin Invest 121（6）：2102-2110。
Walther，TC和Farese，RV，Jr。（2012）。