材料和试剂

无菌血清学转移移液管（Greiner Bio-One，目录号：606107,607107,760107）
无菌离心管（Greiner Bio-One，目录号：188261）
T75培养瓶（Corning，目录号：353135）
24孔板（Corning，Costar ，目录号：3524）
96孔板（Corning，目录号：3596）
人骨髓来源的内皮祖细胞（BM-EPC）[使用Ficoll-Paque密度梯度（1.077g/cm 3）从健康供体的骨髓分离]（Tang等，/em>。，2015）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14190169）
人纤连蛋白（BD Biosciences，目录号：610077）
内皮细胞生长培养基MV2（ECGM2）（PromoCell GmbH，目录号：22121）
青霉素/链霉素（5,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15070-063）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
Dil-ac-LDL（Thermo Fisher Scientific，目录号：L3484）
FITC-UEA-I（Sigma-Aldrich，目录号：L9006）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
Hoechst 33258（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-394039）
Calcein AM（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：L-3224）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
来自猪胰腺的胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4799）
内皮细胞生长培养基（参见配方）
0.2mg/ml Hoechst 33258（参见配方）
2μM钙黄绿素-AM（参见配方）

设备

水平离心机（Eppendorf，目录号：5702RH）
CO 2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026280）
流式细胞仪（LSR II）（BD Biosciences，目录号：342975）
Scepter 2.0H手持式自动细胞计数器，w/50 pk 60μM传感器（Merck，Merck Millipore，目录号：PHCC20060）
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026639）
倒置荧光显微镜（Zeiss，目录号：Apotome.2）

程序

用等体积的DPBS稀释骨髓样品，然后将稀释的样品小心地铺在Ficoll-Paque PLUS的顶部。在400离心机离心30分钟，制动器关闭（图1）。
使用无菌巴斯德移液管从Ficoll-Paque PLUS和血浆之间的界面小心收获单核细胞，并转移到无菌离心管中。
用等体积的DPBS洗涤细胞两次以除去Ficoll-Paque PLUS残余物。洗涤后，将分离的单核细胞培养在用人纤连蛋白（25μg/ml）包被的烧瓶中，并在37℃下用5％CO 2在潮湿空气中的密度为3的ECGM2培养基-5×10 ⁶/cm ²（图2）
培养72小时后，通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤除去非贴壁细胞，应用预热的新鲜ECGM2培养基，并维持培养7天。在本实验中使用的所有细胞在第3至5代用ECGM2培养
在Vantage SE流式细胞仪上进行定量荧光激活细胞分选（FACS），以在7天和14天检测细胞上CD34，CD133，KDR，VE-钙粘蛋白，E-选择素，vWF的表面标志物。
使用Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I进行免疫荧光染色。简言之，细胞首先与Dil-ac-LDL（5μg/ml）在37℃孵育2小时，然后通过与4％多聚甲醛孵育20 min。随后将它们与UEA（10μg/ml）在37℃下温育1小时。用PBS洗涤后，使用荧光显微镜观察细胞并拍照，并以200x放大倍数计数。双阳性细胞被认为是区分EPC。
将5×10 3个BM-EPC在96孔板中过夜，以在ECGM2中汇合为单层。
在37℃下用10μg/ml Hoechst 33258染料在PBS中标记细胞30分钟，然后用PBS洗涤三次。洗涤后，将细胞保存在细胞培养箱中的PBS中，直到接种另一组细胞
来自相同供体的另一组BM-EPC在具有碱性介质（不含任何补充的生长因子或胎牛血清）的96孔板（5×10 3个/孔）中饥饿24小时，并用小分子化合物处理
与待研究的化合物孵育48小时后，用PBS洗涤细胞两次，在37℃下在细胞培养箱中用2μM钙荧光素AM（100μl/孔）温育1小时，随后用PBS洗涤三次。
使用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA（50μl/孔）将细胞分离3分钟，然后用100μlECGM2重悬，并以3×10 3个细胞的密度接种到建立的细胞单层（受体细胞）上 /well。
将培养物在PBS中在37℃下在5％CO 2细胞培养箱中温育20分钟。
之后，使用PBS（100μl/孔）轻轻洗涤培养物三次
用荧光显微镜每隔5分钟监测和记录电镀细胞的附着和铺展（图3）
通过计数每个微观视野中钙黄绿素-AM阳性的细胞数量来进行细胞间粘附的定量。

代表数据

图1.从Ficoll-Paque PLUS和血浆之间的界面收集的细胞的图像。 A.用等体积的DPBS稀释骨髓样品，然后将稀释的样品小心地分层到Ficoll-Paque PLUS。 B.在400×g离心30分钟后，从Ficoll-Paque PLUS和血浆之间的界面收获单核细胞。

图2.单核细胞的光学显微镜图像。使用无菌巴斯德移液管从Ficoll-Paque PLUS和血浆之间的界面小心地收获单核细胞，并转移到无菌离心管中。洗涤后，将分离的单核细胞培养在用人纤连蛋白（25μg/ml）包被的烧瓶中，并在37℃下用5％CO 2在潮湿空气中的密度为3的ECGM2培养基-5×10 ⁶/cm ²

图3.细胞间粘附测定后细胞的荧光显微镜图像。A.将细胞过夜铺板到ECGM2中的汇合单层，并用Hoechst 33258标记细胞。B.代表性荧光显微照片，显示细胞间的细胞粘附测定。

笔记

这个协议可以用于其他细胞系，但我们建议一个试点实验找到使用任何细胞系的最佳条件。这些包括：

最佳细胞密度，由细胞大小（细胞越大，密度越低）和细胞粘附能力等几个参数决定。
附着时间。较弱的贴壁细胞系可能需要较长的温育时间以跟踪粘合剂形成。

食谱

内皮细胞生长培养基
0.02ml/ml胎牛血清 5ng/ml表皮生长因子（重组人） 10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（重组人） 20ng/ml胰岛素样生长因子（Long R3 IGF） 0.5ng/ml血管内皮生长因子165（重组人） 1μg/ml抗坏血酸
22.5μg/ml肝素
0.2μg/ml氢化可的松
100U/ml青霉素/链霉素
0.2mg/ml Hoechst 33258
10mg Hoechst 33258
50ml无菌PBS
将此储备液保存在4°C避光避光。
注意：储备溶液只能保存30天。
2μM钙黄绿素-AM 加入5微升提供的4毫米钙黄绿素AM储备液到10毫升无菌，组织培养级D-PBS，涡旋，以确保充分混合。这产生约2μM钙黄绿素-AM溶液注意：该染色溶液应每次新鲜制备。储备溶液必须保存在-20°C，避光。

致谢

该方案的概念改编自我们以前的研究，其中细胞间粘附测定用于测量内皮祖细胞的细胞 - 细胞粘附能力（Tang，等人，2015）。本研究得到了德国学术交流服务和联邦教育和研究部（D/09/04774）的支持。

参考文献

（a），（b），（c），（c），（c），（c），（d），（d），（d） Icariin促进血管生成分化并防止内皮祖细胞中的氧化应激诱导的自噬。 33（6）：1863-1877。