材料和试剂

螺旋盖2ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：21-403-200）
D-2-羟基戊二酸二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H8378）
L-2-羟基戊二酸二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：90790）
乳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：L7022）
水（LC-MS级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：W6）
[剑桥同位素实验室，目录号：CLM-4442]
甲醇，Optima（LC-MS级）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A454）
二乙酰基-L-酒石酸酐（DATAN）（Sigma-Aldrich，目录号：358924）
乙腈，Optima（LC-MS级）（Fisher Scientific，目录号：A955）
乙酸，冰川（Fisher Scientific，目录号：BP2401）
甲酸，Optima（LC-MS级）（Fisher Scientific，目录号：A117）
氢氧化铵（Fisher Scientific，目录号：A669）
生物样品（见注1）
50 mM D2HG和L2HG储备溶液（见配方）
20μM2HG工作溶液（参见配方）
10 mM乳酸钠储备液（见配方）
500μM内标（ISTD）储备溶液（见配方）
缓冲区A（参见配方）
缓冲液B（参见配方）

设备

Savant SpeedVac ISS110
注意：此设备已被Thermo Fisher Scientific停止销售。
Isotemp数字干浴培养箱（Fisher Scientific，目录号：11-715-125DQ）
Sequencer ZIC-HILIC HPLC柱（3.5μm，内径2.1mm，长度150mm）（Merck Millipore Corporation，目录号：1504420001）
Sequant ZIC-HILIC HPLC保护柱（Merck Millipore Corporation，目录号：1504360001）
Surveyor自动进样器加上
注意：此设备已被Thermo Fisher Scientific停止销售。
Surveyor MS泵Plus
Finnigan LTQ质谱仪注意：此设备已被Thermo Fisher Scientific停止使用。

软件

Xcalibur软件（Thermo Fisher Scientific）

程序

准备标准
1. 通过将0-20μl外消旋20μM2HG工作溶液与2μl各10mM乳酸钠和500μMISTD储备液混合到螺旋盖微量离心管中（表1），在80％甲醇中制备标准品。乳酸盐促进标准品中发现的低浓度2HG的衍生化。
2. 将标准品涡旋并短暂离心
  表1. 2HG标准品的制备
衍生化
1. 将代谢物提取物（200μl）转移到2ml螺旋盖微量离心管中
2. 使用Speedvac旋转蒸发器将标准品和生物样品蒸发至干燥，干燥速率设定为"高"（约65℃烘箱温度）。所有水的完全蒸发是非常重要的，因为衍生化反应不会在水的存在下发生。蒸发也可以在氮气下进行（注2）。
3. 衍生试剂通过将DATAN溶于乙腈：乙酸（4:1，v/v）至50mg/ml制备。酯化反应需要非质子溶剂。乙腈的极性大于二甲基氯化物，我们发现这种溶剂更能溶解干燥的残余物。此外，乙腈与我们的色谱方法直接兼容。
4. 干燥的样品用50μlDATAN溶液处理，并在温度受控的加热块中在70℃加热2小时。衍生标准溶液的颜色从透明变为透明黄色，而样品从透明变为深黄棕色。我们以前使用的衍生化时间短至30分钟，但已经发现2小时导致一致的完全衍生化。
5. 将样品冷却至室温并短暂旋转。
6. 衍生化的样品用50μl乙腈：乙酸（4:1，v/v）稀释，涡旋，短暂旋转，并转移到微量离心管用于LC-MS分析。
  注意：在乙腈：乙酸中稀释对于通过色谱法实现对映体的充分分离是至关重要的。重要的是，该方法不需要在LC-MS分析前进行额外的蒸发和重悬步骤，如其他已公布的方案所要求。
液相色谱
1. 在具有保护柱的ZIC-HILIC固定相上进行分离
2. 流动相由用氢氧化铵，乙腈和LC-MS级水滴定至pH 3.25的LC-MS级水中的200mM甲酸制备。
3. 自动进样器洗涤溶液是LC-MS级水中的95％LC-MS级乙腈。
4. 使用20μl样品注射环以5μl注射样品
5. 使用15％缓冲液A和85％缓冲液B等度洗脱每个样品30分钟进行液相色谱法。
质谱法
1. 使用外消旋2HG的标准溶液调谐质谱仪以优化电离和离子光学。
2. 质谱仪在选择性反应监测模式下操作，并且在色谱运行的持续时间内监测以下质量转变：363> 147 + 129m/z（衍生的2HG），147> 129 m/z（2HG），149> 105 m/z（ISTD）。我们发现147> 129 m/z跃迁远大于363> 147 m/z跃迁，并使用前者定量2HG对映体。我们证实未衍生化和衍生化的2HG峰在色谱上被良好分离，并且使用363>标记物证实了衍生化样品的保留时间。标准样品中147 m/z跃迁（图2）
  
  图2：2HG标准品的衍生制备D2μM（5μM），L2HG（5μM）和D2HG + L2HG（各5μM）的标准溶液，浓度为5μM，溶于200μl80％甲醇。将这些样品蒸发，衍生化，并如上所述通过LC-MS分析。 147>外消旋2HG混合物（紫色痕量）的129m/z提取离子色谱图显示了对应于对衍生的D2HG样品（绿色曲线）和衍生的L2HG样品（蓝色曲线）观察到的保留时间的两个良好分辨的峰。为了清楚起见，绿色和蓝色迹线在Y轴上偏移5,000个强度单位。 363> 147m/z提取离子色谱图（灰色曲线绘制在右Y轴上）证实这些峰代表衍生的2HG。未衍生的2HG洗脱，保留时间为6分钟（未示出）
数据分析
1. 使用Xcalibur软件对D2HG，L2HG和ISTD的色谱峰面积进行积分。
2. 计算峰面积比（D2HG/ISTD和L2HG/ISTD），以生成标准曲线（图3）。
3. 从标准曲线插入每个2HG对映异构体的样品浓度。
4. 2HG的样品浓度应该归一化为样品质量（细胞计数，细胞蛋白质，组织质量）的一些量度
  
  图3.代表性标准曲线

代表数据

图4.来自衍生化细胞提取物的代表性色谱图。肺部成纤维细胞用siRNA处理以沉默L2HGDH的表达，L2HGDH是已知代谢L2HG的唯一酶。 48小时后，使用80％甲醇在干冰上提取代谢物（注1）。将200μl样品蒸发并如上所述进行衍生化。使用Xcalibur软件积分峰面积，发现为：D2HG 967任意单位（AU），L2HG 7,811 AU和ISTD 65,470 AU（色谱图未显示）。因此，峰面积比为：D2HG 0.015和L2HG 0.119。来自标准曲线的内插样品浓度为：D2HG 51nM和L2HG 348nM。通过将浓度乘以总体积100μl来确定衍生化样品中2HG的质量。因此，原始样品含有5.1pmol D2HG和34.8pmol L2HG。我们通常将代谢物质量除以细胞计数以进行归一化。

笔记

来自细胞，组织，血浆和尿液的生物样品可以使用多种方法制备（Yuan等人，2012）。对于我们在6孔培养皿中培养的细胞的研究，我们用2ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水/孔洗涤一次，并将板转移到干冰床。然后加入1ml预冷至-80℃的80％甲醇水溶液和10μl的ISTD。然后将平板在-80℃下温育15分钟。然后通过刮入微量离心管中收集细胞。通过在4℃以15,000×g离心沉淀不溶性物质。将上清液转移到新管中并等分用于LC-MS分析。
我们发现旋转蒸发器更有用，因为它将残余物集中在管底部的小颗粒中，而氮气倾向于将干燥的残余物分散在整个管中。
与DATAN衍生化相比，另一种衍生化试剂TSPC最近已被报道具有改善的灵敏度（Cheng等人，2015）。

食谱

50mM D2HG和L2HG储备液
准备50 mM D2HG和L2HG储备液的水溶液
等分并存储在-20°C，直到使用
20μM2HG工作溶液

将50mM原液稀释至1mM
2μlD2HG
2μlL2HG
96μlLC-MS级水
进一步稀释1 mM 2HG至20μM的LC-MS级水

10mM乳酸钠储液
准备10mM水溶液
等分并存储在-20°C，直到使用
500μM内标（ISTD）储备液
在甲醇中制备500μM的[13 C] 4 - [2-氧代戊二酸二钠盐]储备溶液。
存储在-80°C用作ISTD
注意：在同位素标记的外消旋2HG内标的衍生化之前，还可以化学还原（例如用锌）同位素标记的2-氧戊二酸。
缓冲区A
10％200mM甲酸
90％LC-MS级水
缓冲区B
10％200mM甲酸
90％乙腈

致谢

该协议改编自以前的出版物（Struys，2013）。这项工作得到了NIH/NHLBI（HL007633到WMO，HL061795，HL108630和GM107618到JL）和Brigham and Women's Hospital Department of Medicine的支持。

参考文献

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在这种情况下，我们可以使用一个简单的例子来说明这个问题。（a）：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26458332"target ="_ blank">通过手性衍生化与液相色谱/质谱分析结合，敏感测定D-和L-2-羟基戊二酸对映异构体的代谢产物。 Sci Rep 5：15217.
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在这种情况下，我们的研究结果表明，这些研究结果表明，这些研究结果可以帮助我们更好地理解这些研究结果。（Intlekofer，AM，Dematteo，RG，Venneti，S.，Finley，LW，Lu，C.，Judkins，AR，Rustenburg，AS，Grinaway，PB，Chodera，JD，Cross，JRand Thompson， ; 缺氧产生L-2-羟基戊二酸。 Cell Metab 22（2）：304-311。
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