材料和试剂

微量离心机或PCR管（200μl）
移液器（0.1-10μl和10-200μl）和相应的提示
0.22μm滤膜
dsDNA分析物（Takara，目录号：3420A）
dsRNA（包括siRNA）分析物（Takara，目录号：3430）
超纯水，电阻为18.25欧姆
2-羟乙基纤维素（MW：1300k）（Sigma-Aldrich，目录号：434981）
TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）粉末（Takara，目录号：T905）
SYBR Green II RNA凝胶染色剂，DMSO中10,000x浓缩物（Thermo Fisher Scientific，目录号：S-7564）
存储1％HEC聚合物溶液（参见配方）
0.5x TBE解决方案（参见配方）
100x SYBR Green II（请参阅配方）

设备

家用CE系统（图1），包括：

具有检测窗的涂覆的熔融石英毛细管（Polymicro，目录号：TSP075375）
高压电源（见注8）
装配有荧光激发设备（设备1d）和荧光发射收集设备（设备1e）（Olympus，型号：IX73）的荧光显微镜
由汞灯和光学立方体构成的荧光激发设备用于将来自汞灯的光传输到460-495nm荧光激发光谱（Olympus，型号：U-MWIB3）。
由滤光器和光电倍增管（PMT）（Hamamatsu Photonics，目录号：H8249-101，用于交替的H7827-001）构成的荧光发射收集设备
注意：光学滤镜将染料 - 核酸共轭的发射光谱传输到PMT，并从检测窗口过滤出背景光。
包括Labview系统（国家仪器，型号：NI USB 6212）和计算机的本地CE系统
注意：用户可以通过LabVIEW软件控制高压供应商，从检测窗口监测荧光信号并从PMT收集数据。

真空泵（见注9）
离心机（> 3,200 x g ）
超纯水系统（见注10）

图1. CE系统装配示意图

软件

LabVIEW软件

程序

准备CE样品。将dsDNA/dsRNA分析物收集到微量离心管中，例如，200μl体积的微量离心管中。用0.5x TBE溶解或稀释dsDNA/dsRNA分析物（见注释3）。
制备0.5％HEC聚合物溶液（见注4）。取一个微量离心管，移液至100μl储存1％HEC聚合物溶液，然后加入96μl0.5x TBE溶液和4μl100x SYBR Green II。通过吸移混合缓冲液几次。在另一个微量离心管中分离0.5％HEC聚合物溶液。离心微离心管5-20秒，以便从缓冲溶液中去除气泡。在这种情况下，我们以0.5％HCE为例。聚合物溶液的浓度大大影响了CPE的分离性能（Liu等人，2015）。建议用户根据要分析的样品调整聚合物溶液的浓度
清洁毛细管的内壁（图2）。使用真空泵用超纯水冲洗毛细管约30秒。样品将在毛细管的阴极端注入。为了避免不适当的样品注入，我们建议将真空泵放置在毛细管的阳极端
按照与步骤3相同的方式将0.5％HEC聚合物溶液填充到毛细管中（图2）。

图2.将0.5％HEC聚合物溶液填充到毛细管中并清洁毛细管内壁的示意图
在Labview界面上设置CE参数：样品加载电压，样品加载时间，电场强度。当分析不同的样品时，这些参数应被优化以实现优选的分离
注入样品。如图3所示，将电源的阴极和毛细管的相应端浸入微量离心管中的样品溶液中。将电源的阳极和毛细管的相应端浸入含有0.5％HEC聚合物溶液的微离心管中。确保毛细管与电源良好连接。通过安装在计算机上的LabVIEW控制软件，设置在高压电源上。这样，高电压施加在毛细管上，样品被电动注入

图3.注入样品的示意图
启动CE分离。取出样品微量离心管，并以??相同的方式放置含有0.5％HEC聚合物溶液的微量离心管。确保毛细管与电源连接良好。
在CE分离过程中，可以通过LabVIEW软件监测荧光信号。在第一次CE运行中，当观察到最后一个信号时，应保持CE过程持续另一个相同的持续时间，以确保没有其他信号出现。保存CE数据。继续数据分析。
在步骤3之后，清洁毛细管的内壁。清洁防止下一个CPE运行受到污染。如果不需要更多的CPE运行，它有助于保持毛细管长期储存

代表数据

图4.（a）dsRNA片段和（b）dsDNA片段在1.2％HEC（MW：1,300k）溶液中的电泳图。在100V/cm下进行毛细管电泳。毛细管的总长度和有效长度分别为9.0cm和6.0cm。将样品在100V/cm下加载2.0秒。使用0.5x TBE将dsDNA样品和dsRNA样品分别稀释到13ng /μl和20ng /μl。

笔记

变性对于dsDNA和dsRNA分子的电泳分离不是强制性的
您可以将dsDNA和dsRNA分析物保持在4°C进行短期储存，并将其保存在-20°C下长期储存。
分析物建议分解为0.5×TBE，以确保每次电动注射相同。
因为聚合物溶液是粘稠的并且需要很长时间才能得到均匀的分散，所以建议制备浓缩的聚合物溶液用于储存。在CPE实验之前，可以方便地将浓缩的聚合物溶液稀释至所需浓度。在这种情况下，我们演示了制备最终浓度为0.5x TBE和2x SYBR Green II的0.5％HEC聚合物溶液的方案。
各种MW中的HEC聚合物，例如90k-1,300k，可用于dsDNA和dsRNA分析。如果HEC聚合物的MW低，则建议高浓度用于dsDNA和dsRNA分离
SYBR Green I也可用于dsDNA和dsRNA死亡
建议将毛细管保存在超纯水中进行储存，以保持涂层表面的性能
请确保高电压的纹波小于施加电压的0.1％，高电压的转换速率应大于20 V /μsec。这些参数通常写在产品规格中。
如果毛细管长，推??荐高泵压力或注射器，以便将粘稠的聚合物溶液填充到毛细管中。如果毛细管短，则在毛细管内形成气泡的情况下优选低压。在我们的实验室，共同的毛细管长度不超过20厘米。我们的真空泵的最终压力为26.6×10 3 Pa
超纯水系统应产生符合ASTM（美国测试材料学会）1.1型标准的水
我们相信，商业可用的CE系统与该协议兼容以适应实验过程。

食谱

储存1％HEC聚合物溶液，10ml
1 g HEC粉末
9 ml 0.5x TBE
在室温下将溶液搅拌至少24小时，以获得均匀的聚合物溶液。将聚合物溶液保持在室温。
0.5x TBE 1,000 ml
50 ml 10x TBE
950毫升超纯水
使用0.22μm滤膜过滤0.5x TBE溶液两次。
保持室温。
100x SYBR Green
1μl10,000x SYBR Green
99μl超纯水
保持在2-8°C至少一个月。

致谢

这项工作由Yamaguchi和Liu等人2015年修订和修订。
该项目得到了科学研究助理的部分支持[No. 25600049（Y.Y.），A15H038270（Y.Y）]，JSPS，Japan。我们承认华东理工大学的部分资金支持（No. YK0142119）。

参考文献

（a），（a），（b），（c），（c），（c），（d），（d）/p> 1229：对于毛细管电泳中的RNA分离，脉冲电场仍然有效吗？ 1229： 274-279。
Liu，C.，Yamaguchi，Y.，Zhu，X.，Li，Z.，Ni，Y.and Dou，X.（2015）。通过毛细管电泳在羟乙基纤维素溶液中分析小干扰RNA。 36（14）： 1651-1657。

Sumitomo，K.，Sasaki，M。和Yamaguchi，Y。（2009）。

Todorov，TI，Yamaguchi，Y。和Morris，MD（2003）。尿素对用于核酸电泳分离的聚合物缓冲溶液的影响。 Anal Chem 75（8）：1837-1843。

Yamaguchi，Y.，Todorov，TI，Morris，MD和Larson，RG（2004）。在半纯和稀释的羟乙基纤维素溶液中单个DNA分子电泳迁移的分布。电泳 25（7-8）：999-1006。