材料和试剂

0.22μmMillex-GP注射器过滤装置（Sigma-Aldrich，目录号：Z359904）
96孔微量滴定板（Eppendorf，目录号：0030602200）
柱C18,5μm，250×4.6mm（Phenomenex，目录号：00G-4041-E0）
碳导电胶带（Ted Pella，Inc.，目录号：16084-7）
玻璃载玻片（HiMedia，目录号：CG081）
Whatman 1号纸（Sigma-Aldrich，目录号：Z274852）
玉米赤霉烯酮生产。禾本科 [The Microbial Type Culture Collection and Gene Bank，（MTCC），目录号：1893]
玉米谷物（当地农业市场，印度迈索尔）
玉米赤霉烯酮标准品（Sigma-Aldrich，目录号：Z2125）
二甲基亚砜（Merck Millipore，目录号：317275）
蒸馏水
氯化钠（NaCl）（Merck Millipore，目录号：1064040500）
氯化钾（KCl）（Merck Millipore，目录号：1049360250）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Merck Millipore，目录号：567550-1KG）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Merck Millipore，目录号：1048730250）
0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH6.5）（Sigma-Aldrich，目录号：70114）
25％戊二醛（Merck Millipore，目录号：354400）
乙腈（Merck Millipore，目录号：100030）
乙醇（Merck Millipore，目录号：100983）
金箔（Sigma-Aldrich，产品编号：265829）
ZEA（Vicam，目录号：G1026）的免疫亲和柱
使用SYBR Green（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708892）的iScript One-Step RT-PCR试剂盒
液氮（本地供应商，印度迈索尔）
无核酸酶水（Qiagen，目录号：129114）
制霉菌素（Sigma-Aldrich，目录号：N6261）
洋葱香精（OSEO）（按程序步骤2中所述制备）
蛋白胨（HiMedia，目录号：RM001-500G）
瓷研钵（Sigma-Aldrich，目录号：Z529508）
RNA easy plant Mini kit（Qiagen，目录号：74903）
Sabouraud葡萄糖琼脂（HiMedia，目录号：M063-500G）
Sabouraud葡萄糖肉汤（HiMedia，目录号：M033-500G）
合成的引物序列（Sigma-Aldrich，Bangalore，India）
吐温80（Merck Millipore，目录号：822187）
乳糖苯酚蓝（HiMedia，目录号：S016-500ML）
磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）（参见配方）
乳糖 - 棉蓝染色溶液（见配方）

设备

Milli-Q一体式水净化系统（Merck Millipore，目录号：ZRXQ005WW）
铝棒（Ted Pella，Inc.，目录号：16111N）
高压灭菌器（Medica Instrument Manufacturing Company，型号：7431PAD）
微量离心机（Sigma-Aldrich，Eppendorf，型号：5415R）
离心机（Eppendorf，型号：5430R）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
热风炉（Memmert，型号：UFP800DW）
孵化器（Bio-age，型号：BSR-R2）
实时PCR系统（Roche Diagnostics，Light cycler ，型号：480）
0.5-10μl微量移液管（Eppendorf Research plus，目录号：3120000020）
20-200μl微量移液管（Eppendorf Research plus，目录号：3120000054）
100-1000μl微量移液管（Eppendorf Research plus，目录号：3120000062）
显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DM 1000LED）
250ml锥形瓶（Duran Group，目录号：21-23636）
500ml锥形瓶（Duran Group，目录号：21 216 44）
NanoDrop 8000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，目录号：ND-8000-GL）
Nexera UHPLC系统（Shimadzu Corporation，型号：Nexera X2）
扫描电子显微镜（FEI，型号：Quanta 200）
注意：此产品已由制造商[可更换项目（FEI，型号：Quanta 250/450/650）]停产。
摇床培养箱（Bio-age，型号：BSR-R1）
溅射涂布机（Quorum Technologies，型号：SC7620）
水浴（NUVE，型号：NB 5）
称重天平（丹佛仪器，型号：TB-215D）

软件

GeneRunner软件版本5.0.47 Beta

程序

生长玉米赤霉烯酮（ZEA）产生F。（MTCC，1893）在Sabouraud葡萄糖琼脂（SDA）上在28℃下培养7天，并将孢子收集在含有0.001％Tween 80的蛋白胨水中，并用软刮刀收集。使用血细胞计数器确定孢子的数量，并将孢子悬浮液调节至1×10 6/ml。
收集罗勒属密苏里植物并鉴定其植物学命名，并在室温下在黑暗条件下干燥植物。按照欧洲药典（欧洲委员会，1997年）的技术从干燥的地面部分提取精油。制备0.05％OSEO的DMSO溶液注意：在本研究中，从印度卡纳塔克邦的迈索尔收集了圣罗勒（Rosimum sanctum L.），并通过印度植物调查局（印度哥印拜陀）进行了鉴定。
确定OSEO在F上的最小抑制（MIC）和最小杀真菌浓度（MFC）。（2008）和Vieira等人的方法，通过微孔稀释技术在96孔微量滴定板中对禾谷镰刀菌进行培养。（2014年）进行了以下小改动。
1. 向不同浓度的OSEO中加入10μl孢子悬浮液（每ml 1×10 6个孢子），并用Sabouraud葡萄糖肉汤（SDB）将每个孔的总体积调整到100μl。
2. 考虑没有OSEO作为对照的孔，并在28℃下在黑暗中孵育微板3天。
3. 观察OSEO的最小浓度，没有可检测的真菌生长，并确定为最小抑制浓度（MIC）。
4. 将平板从SDA板上的每个孔中10μl铺在板上，并在28℃下孵育3天
5. 确定没有可检测到的真菌生长的OSEO的最小浓度并确定为MFC，与制霉菌素（阳性对照）相比，指定99.5％的原始接种物的杀灭。
图1.O的最小抑制（MIC）和最小杀真菌浓度（MFC）的测定。圣地牙本精油（OSEO）。通过微孔稀释法。在对照（未处理的OSEO）中观察到真菌生长，并且在OSEO的MFC值没有观察到可检测到的生长。
分析OSEO对F的孢子萌发的影响。禾谷镰菌通过Rana 的方法。（1997）略有修改。

在含有不同浓度的OSEO（100-1,800μg/ml）的SDA载玻片上接种10μl真菌孢子悬浮液（每ml 1×10 6个孢子），并在28℃下孵育24小时。
考虑单独的SDA载玻片与真菌孢子和没有OSEO作为对照。
孵育后，通过滴落法在28℃下用乳糖醇 - 棉蓝（100μl）对每个载玻片染色15分钟，并在显微镜下观察胚芽管。
从每个幻灯片检查至少200个孢子，并使用公式计算孢子萌发的百分比，
％孢子萌发= ST/SC×100
其中，SC是对照中发芽的孢子数，ST是试验中发芽的孢子数

确定OSEO对EM的菌丝体和孢子结构的影响。根据Yamamoto-Ribeiro等人的方法通过扫描电子显微镜（SEM）观察来检测禾谷镰刀菌。（2013）略有修改。
1. 从7天的F培养物中收集1cm 2的菌丝盘。禾谷镰刀菌，并在含有不同浓度的OSEO的SDA培养皿的中间无菌接种，并在28℃在黑暗中孵育7天。
2. 考虑没有OSEO的SDA介质作为控制。
3. 孵育后，收集1cm 2的菌丝盘并在磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中漂洗并用2.5M戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液（pH 6.5）中固定，并用梯度乙醇脱水（20,40,70,90和100％，保持菌丝体在100％中更长的持续时间）。
4. 将样品粘贴在双面胶碳导电胶带上，并固定到铝棒的表面。
5. 此外，在CO 2中暴露出临界点的短棒，并用金溅射涂层以增加其导电性。
6. 在环境模式下，在20.0 KV下，在扫描电子显微镜下观察菌丝体的形态学质量。
图2.确定O的抗真菌活性。圣地牙本香精油（OSEO）。禾谷镰刀菌通过扫描电子显微镜观察（Kalagatur等人，2015）。对照（OSEO未处理的）菌丝（a）是平滑的，湍流和同质的。而用MIC（b）和OSEO的MFC（c）值处理的菌丝表现出凹坑，突起和塌陷。对照（OSEO未处理的）孢子（d）是圆形和光滑的，另一方面，用MIC（e）和MFC（f）处理的孢子被OSEO破坏和起皱。
确定液体培养物中OSEO的抗真菌毒性活性。向每个含有100ml SDB的250ml锥形瓶中加入不同浓度的OSEO，包括250,500,1,000,1,500和2,000μg/ml。在无菌条件下将10μl7天龄培养物的10μl真菌悬浮液（1×10 6个孢子/ml）接种到这些烧瓶中。考虑没有OSEO的烧瓶作为对照，在摇动条件下（140-160rpm）在28℃下在黑暗中孵育烧瓶14天。
在孵育期后，通过用Whatman no.1纸过滤将培养基与真菌生物质分离，并使用肉汤用于测定ZEA。用无菌蒸馏水洗涤真菌菌丝体两次，并使用10毫克菌丝体进行RNA提取，并将剩余的菌丝体包装在预先称重的Whatman no.1滤纸中，并在60℃干燥24小时，并通过以下步骤测定菌丝体生物量：称重。
通过UHPLC通过Ibá?ez-Vea等人的方法检测和定量ZEA。（2011）略有修改。

将培养液与等量的乙腈在140rpm下在摇床培养箱中混合30分钟。
随后，通过在4226.04×g离心12分钟收集样品的上清液，并将15ml上清液通过ZEA的免疫亲和柱，其在10ml磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）。
接下来，用5ml PBS和10ml蒸馏水洗涤柱子。
最后，空气干燥柱并用5ml乙腈洗脱ZEA。保持乙腈和柱抗体之间的接触至少5分钟。
将洗脱液在60℃的水浴中完全干燥，并将最终残余物再溶解于1ml乙腈中，并通过0.22μm注射器过滤器过滤。
使用滤液进行UHPLC测定和ZEA的定量。

使用与C18，5μm，250 x 4.6 mm色谱柱相连的Nexera UHPLC系统，用于用荧光检测器反相检测和定量ZEA，并分别在334和450 nm处设置激发和发射波长。
流动相为乙腈 - 水（50:50，v/v），流速为1ml/min。
构建具有峰面积对ZEA浓度的标准ZEA（100ng-500μg/ml）的五点校准曲线。
标准溶液和测试样品的注射体积为25μl。
该技术的感测限制为100ng/ml。

确定OSEO对PKS4和PKS1 3的基因表达的影响，其参与F的ZEA生物合成。禾谷镰刀菌（Graminearum）（Gaffoor和Trail，2006; Kim等人，2005）通过RT-qPCR评价，使用GAPDH作为内源参照基因。
1. 使用GeneRunner软件版本5.0.47 Beta设计靶基因的引物（表1）。
2. 简言之，在液氮中快速冷冻菌丝体并用瓷研钵研磨成细粉末。使用RNEASY PLANT MINI KIT根据制造商的指南（Qiagen，Hilden，Germany）提取总RNA。
3. 通过NanoDrop 8000分光光度计定量总RNA。
4. 使用具有SYBR Green（Bio-Rad Laboratories，USA）的iScript One-Step RT-PCR试剂盒在Light Cycler 480中进行PKS4和PKS13的RT-qPCR分析。。
图3.O的抗真菌毒性活性的测定。圣地牙本香精油（OSEO）。通过UHPLC和RT-qPCR分析测定禾谷镰菌。通过UHPLC测定肉汤培养物中存在的ZEA的定量，ZEA的浓度随着OSEO浓度的增加而下降。通过RT-qPCR分析测定PKS4和PKS13的相对折叠表达，并且随着OSEO浓度的增加而下调。
OSEO对抗真菌毒性效力的评价。禾谷镰菌。
1. 通过高压灭菌器灭菌种子，在60℃的热风烘箱中干燥2小时。
2. 在500ml锥形瓶中处理100g各种浓度（250,500,1,000,1,500和2,000μg/g）的OSEO的灭菌的玉米粒，并接种10μl的真菌孢子悬浮液（1×10 6/孢子/ml）的7天龄培养物，并在28℃在黑暗中孵育14天。
3. 考虑未用OSEO处理的谷物作为对照，并在28℃在黑暗条件下孵育14天的时间。
4. 在孵育期后，从真菌菌丝体提取总RNA，并如前所述对PKS4和PKS13基因进行RT-qPCR评价。
5. 此外，将玉米粒磨成细粉并溶解在500ml乙腈中，并在4226.04×g离心30分钟。
6. 通过ZEA特异性免疫亲和柱转移15ml上清液，并如前所述通过UHPLC定量ZEA。
表1.用于玉米赤霉烯酮生产的RT-qPCR分析的引物

食谱

磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）
8.0克NaCl 0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4 sub/
乳糖 - 棉兰染色溶液
20ml乳酸 20克苯酚晶体
0.05克棉蓝
20ml甘油 20ml蒸馏水

笔记

玉米赤霉烯酮是有毒的，并且被国际癌症研究机构（IARC，1999）分类为第3组致癌物，并且应该注意。

致谢

作者感谢DFRL和DRDO-BU-CLS主任对本研究的支持，并感谢Rana等人。（1997），Clinical and Laboratory Standards Institute，（2008），Ibá?ez-Vea等人。（2011），Yamamoto-Ribeiro等人。（2013）和Vieira等人。（2014年）。该协议从Kalagatur等人的报告中被邀请。（2015）和Kumar等人。（2016年）。

参考文献

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（a）：a class ="ke-insertfile"href（a），a，b，c，e，e，e，e， ="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814611000720"target ="_ blank"验证UHPLC-FLD方法，用于同时定量大麦中的黄曲霉毒素，赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮。食品化学，127（1），351-358
John，H。和Mahmoud，A.（eds）（2008）。酵母菌液稀释抗真菌药敏试验的参考方法;批准的标准 - 第三版，M27-A3。 CLSI 。
Kalagatur，NK，Mudili，V.，Siddaiah，C.，Gupta，VK，Natarajan，G.，Sreepathi，MH，Vardhan，BH和Putcha，VL（2015）。罗勒属密室的拮抗活性 L.精油对生长和玉米赤霉烯酮生产的影响禾本科镰刀菌。 6：892。
Kim，YT，Lee，YR，Jin，J.，Han，KH，Kim，H.，Kim，JC，Lee，T.，Yun，SHand Lee，YW（2005）。在玉米赤霉中合成玉米赤霉烯酮需要两种不同的聚酮化合物合酶基因。 Mol Microbiol 58（4）：1102-1113。
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Rana，BK，Singh，UP和Taneja，V。（1997）。抗真菌活性和由从Aegle marmelos的叶分离的精油的抑制动力学。 57 Ethnopharmacol 57（1）：29-34。
Vieira，PRN，de Morais，SM，Bezerra，FHQ，Ferreira，PAT，Oliveira，IR和Silva，MGV（2014）。