材料和试剂

25号针（BD Biosciences，目录号：305122）
细胞过滤器（100μm孔径）（Corning Incorporated，目录号：352360）
15ml管（TPP，目录号：91015）
1ml注射器（BD Biosciences，目录号：309659）
1ml具有30号针头的注射器（BD Biosciences，目录号：328278）
B6小鼠（Jackson Laboratories，型号：B6）
B6.CD11c-DTR小鼠（Jackson Laboratories，型号：C57BL/6）
白喉毒素（Sigma-Aldrich，目录号：D0564）
氯化钠（Melone Pharmaceutical，目录号：22560-50-5）
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，目录号：11875093）
胎牛血清热灭活（Thermo Fisher Scientific，目录号：10437028）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：11360070）
2-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific，目录号：21985023）
氟烷（Sigma-Aldrich，目录号：H0150000）
MARCO的单克隆抗体（mAb）（R& D Systems，目录号：FAB2956P）
mAb至MOMA-1（Abcam，目录号：ab51814）
mAb至F4/80（eBioscience，目录号：47-4801）
mAb到CD11b（BD Biosciences，目录号：562950）
mAb到CD11c（eBiosciences，目录号：17011482）
mAb至I-Ab（eBiosciences，目录号：46532082）
NaCl
KCl
Na HPO ₄
KH ₂ PO ₄
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）（参见Recipes）
染色缓冲液（参见配方）
补充的RPMI 1640（见配方）
ClLip（参见食谱）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5804）
层流罩（AirClean Systems，目录号：AC8000HLF）
FACSCanto II流式细胞仪，8色，激光蓝/红/紫（BD Biosciences，目录号：338962）
推拉注射泵（KD Scientific，型号：KDS120）

程序

在B6.CD11c-DTR小鼠中DCs耗尽
1. 注射B6.CD11c-DTR小鼠（6-8周龄）i.p 。用2ng/g体重的DTx（每只小鼠200μl体积），或用PBS作为耗尽对照（每只小鼠200μl体积），使用具有25号针头的注射器。
2. 注射后24小时，通过吸入（或其他批准的安乐死方案）用氟烷安乐死小鼠。
3. 取出脾并在无菌培养罩（用5ml补充的RPMI 1640）内的细胞过滤器中处理，然后用RPMI洗涤两次（300×g，5分钟，4℃）。
4. 然后将脾细胞用mAbs（0.5μl/10 6个细胞 - 每个mAb，初始0.5mg/ml浓度，在25μl的染色缓冲液中稀释）稀释到CD11c和I-Ab（1个孵育期30分钟），重悬于染色缓冲液（200μl）中并在FACSCanto装置中分析，以评价消耗效率。
使用ClLip的B6小鼠中的MZMΦs耗尽
1. 注射B6小鼠（6-8周龄）i.v 。（van Rooijen等人，1993）中所述制备的8.5μg/g体重的ClLip（每只小鼠200μl），或用PBS装载的脂质体（每只小鼠200μl，8.5μg/μg/g体重）作为消耗对照，使用具有30号针头的注射器
2. 注射后24小时至7天，通过吸入（或其他批准的安乐死方案）用氟烷安乐死小鼠，并用具有25号针的1ml注射器通过心脏穿刺放血。
  注意：在两个时间点，在我们的方案中仅消耗MZMΦ（这是作为对照进行的，以确保在我们的方案中仅消耗MZMΦ，与注射更高浓度的ClLip相反）。
3. 取出脾并在无菌培养罩（用5ml补充的RPMI 1640）内的细胞过滤器中处理，然后用RPMI洗涤两次（300×g，5分钟，4℃）。
4. 然后将脾细胞用mAb（0.5μl/10 6个细胞 - 每个mAb，初始浓度为0.5mg/ml，稀释在25μl的染色缓冲液中）染色至MARCO，MOMA-1，CD11b，CD11c和I-Ab（1个孵育时间为30分钟），重悬于染色缓冲液（200μl）中并在FACSCanto装置中分析，以评估消耗效率。用该实验获得的结果的实例分别示于图1A和1B中注意：不同的DC子集可能对DTx治疗具有不同的敏感性，在初始消耗后具有不同的再生速率。因此，对于长时间的实验，一个重要的步骤将是对感兴趣的DCs亚群进行繁殖率测定。
  
  在脾脏DC和MZMΦ的体内耗尽 A.使用DTX处理的??枯竭B6小鼠作为对照的DC消耗的小鼠的代表性图这里，如在每个直方图的右上方的门中所示，用DTx处理的CD11c-DTR小鼠存在具有较低百分比的CD11c ^{+ IA ⁺ DC使用ClLip处理的B6小鼠（在此为ClLip），作为对照的用MZMΦ消耗的小鼠的代表性图处理的小鼠存在具有较低百分比的MARCO + MOMA-1 ⁺MZMΦs，如在每个直方图中表示的门中所示（这个百分比的减少是细胞的指示耗尽），改编自博尔赫斯·达席尔瓦等人（2015）。}

食谱

1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将以下物质溶于800ml蒸馏H 2 O中 8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4 sub/
用额外的蒸馏H 2 O 2调节体积至1L 消毒溶液
注意：使用HCl和NaOH调整pH值。
染色缓冲液
将以下物质溶于200ml PBS中
1ml 10％叠氮化物 2ml胎牛血清热灭活
补充RPMI 1640
将下列物质溶于200ml RPMI 1640培养基中 2ml L-谷氨酰胺 20ml胎牛血清热灭活
2 ml丙酮酸钠 2ml青霉素 - 链霉素 200μl2-巯基乙醇
ClLip
1. 通过使用适合于推拉式注射泵的注射器，将50mg磷脂酰胆碱和8mg胆固醇的醚溶液注射（0.2ml/min）到保持在42℃的5ml 50mM/L氯膦酸盐水溶液中使用细针（N ^{o ）}
2. 在注射期间，氮气流将注入氯膦酸盐溶液中，直到形成脂质体并除去残余溶剂。
3. 离心脂质体悬浮液（22,800×g/30分钟，25℃）。用PBS洗涤两次，并悬浮在2ml PBS中
4. 通过0.8μm聚碳酸酯膜过滤。

致谢

HBDS获得FAPESP（编号：2014/00810-5）的奖励支持，MRDL由FAPESP（编号：2013/07140-2）和CNPq 303676/2014-0（MRDL）和448765/2014-4（MRDL）。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发布或准备手稿方面没有任何作用。 DTX介导的DC的耗竭源自Jung等人。（2002），并且ClLip介导的MZMΦ的消耗从McGaha等人改编。（2011）。

参考文献

Borges da Silva，H.，Fonseca，R.，Cassado Ados，A.，Machado de Salles，E.，de Menezes，MN，Langhorne，J.，Perez，KR，Cuccovia，IM，Ryffel，B.，Barreto， VM，Marinho，CR，Boscardin，SB，Alvarez，JM，D'Imperio-Lima，MR和Tadokoro，CE（2015）。体内方法揭示了DC在CD4 ⁺ T细胞活化和寄生虫清除期间的关键作用实验性血液阶段疟疾的急性期。 PLoS Pathog 11（2）：e1004598。

Jung，S.，Unutmaz，D.，Wong，P.，Sano，G.，De los Santos，K.，Sparwasser，T.，Wu，S.，Vuthoori，S.，Ko，K.，Zavala，F 。，Pamer，EG，Littman，DRand Lang，RA（2002）。 CD11c ⁺树突状细胞的体内消耗消除了外源性细胞相关抗原对CD8 + sup/T细胞的引发。 a> 免疫力 17（2）：211-220

McGaha，TL，Chen，Y.，Ravishankar，B.，van Rooijen，N.和Karlsson，MC（2011）。 "in vivo"通过脂质体介导的"自杀"消耗巨噬细胞。