材料和试剂

培养皿（直径5.5cm至9cm）
Falcon管50ml和15ml
Eppendorf管2ml（通过高压灭菌器灭菌）
巴斯德移液管（直径1mm）
刷（达芬奇，型号：Nova合成系列1570，＃3）
12孔和24孔组织培养板（生长增强处理，γ-灭菌，不含热原，不含DNA/RNA，DNase/RNase）
滤盘（Sartorius AG，??目录号：FT-3-205-055）
Falcon细胞过滤器40μm和100μm（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-771-1和08-771-19）
用于24孔板，1μmPET（Merck Millipore Corporation，目录号：PIRP12R48）的悬挂插入件
27G针（Braun，Sterican ^TM，目录号：4657705）
六周龄的小鼠
注意：6-8只小鼠用于内皮和周细胞分离，至少1只小鼠用于神经球共培养测定
4周龄的小鼠
注意：一次准备需要4只用于星形胶质细胞分离的小鼠。
蒸馏水
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）（Sigma-Aldrich，目录号：P7280）
层粘连蛋白（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：R11243217001）
70％乙醇
HBSS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14175）
来自肠炎明串珠菌的葡聚糖平均分子量为150,000（Sigma-Aldrich，目录号：D4876）
没有谷氨酰胺的DMEM/F-12（储存在4℃）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21331020）}
具有L-谷氨酰胺和15mM HEPES（储存在4℃）的DMEM/F-12（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11330032）
B27（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：0080085SA）
MCDB131培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：10372-019）
Glutamax（100×储液）（在4℃储存）（Thermo Fisher Scientific，CTS ^TM，目录号：A12860-01）
胰蛋白转铁蛋白 - 硒（ITS）预混合物（-20℃保存）（Thermo Fischer Scientific，Corning ^{TM，目录号：CB-40351）}
非必需氨基酸（100×储液）（在4℃储存）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11140-035）}
Pen/Strep 100,000U/ml（-20℃）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140）
肝素（储存在4℃）（MP Biomedicals，目录号：0210193125）
胶原酶A（Sigma-Aldrich，Roche，目录号：10103578001）
胎牛血清（FBS）（-20℃）（Merck Millipore Corporation，Biochrom，目录号：S0613）
血浆来源的血小板血清（Sigma-Aldrich，目录号：P2918）
人EGF（在-20℃下储存等分试样）（PEPROTECH，目录号：AF100-15）
人类FGF碱性（在-20℃下储存等分试样）（PEPROTECH，目录号：100-18B）
人VEGF（储存在-20℃的等分试样）（PEPROTECH，目录号：100-20）
Accutase（储存在4℃）（GENTAUR，PAA Laboratories GmbH，目录号：L11-007）
神经组织解离试剂盒（P）（Miltenyl Biotec，目录号130-092-628）
胰蛋白酶/EDTA（-20℃保存）（Merck Millipore Corporation，Biochrom，目录号：L2153）
含2％FBS的PBS（参见配方）
30％葡聚糖溶液（见配方）
内镜媒体（见配方）
星形胶质细胞（见食谱）
周细胞/平滑肌细胞培养基（见配方）
神经球媒体（见配方）

设备

解剖工具：剪刀，小刮刀，细弯曲镊子和手术刀（见图2B）
7ml dounce组织研磨机（Capitol Scientific，Wheaton，目录号：357542）
高压灭菌器
真空泵
Dounce匀浆器
解剖显微镜（奥林巴斯，型号：SZ61）
倒置显微镜（Olympus，型号：CKX41）
刻度板插入显微镜（Olympus）的目镜
冷却离心机配备2ml管（Eppendorf，型号：5430R）
用于15ml管（Eppendorf，型号：5810R）的回转桶离心机
在37℃，5％CO 2/v/v的培养箱中
管旋转器或轨道振动器

程序

注意：有关隔离过程的一般概述，请参见图1。

一般准备
1. 在从组织分离内皮细胞之前至少两天，制备4个聚-D-赖氨酸（PDL）/层粘连蛋白包被的12孔板（每个板包被至少3个孔）。为了制备孔，加入足够的PDL（在dH 2 O中5μg/ml）以包被表面并在室温下温育过夜。从盘中取出溶液，用dH 2 O洗涤该盘三次。让空气干燥。加入层粘连蛋白（5μg/ml，在冷DMEM：F12中），并在37℃下孵育过夜。去除层粘连蛋白，并立即使用板或与层粘连蛋白储存在-20°C，直到需要。
2. 在星形胶质细胞分离之前至少一天制备PDL包被的平板（每个平板涂覆至少3个孔）。每孔加入足够的PDL（5μg/ml，在dH 2 O中）以包被表面，并在室温下温育过夜。从盘中取出溶液，用dH 2 O洗涤该盘三次。加入dH 2 O并在-20℃下冷冻或直接使用。
3. 通过在火焰中旋转玻璃巴斯德移液管，准备具有"中"和"小"孔的火抛光移液管，直到边缘变圆。我们测量到我们的"小"孔大约为0.3-0.4mm，而"中"孔的内径大约为0.6-0.8mm。高压灭菌移液器消毒。
微血管内皮细胞和周细胞/血管平滑肌细胞（vSMC）的分离
注意：隔离程序的概述可以在图1中找到。隔离程序的逐步图片系列可以在图2和3中找到。
在共培养前两周，在6至8周龄时，从6只至8只小鼠分离内皮细胞和周细胞/vSMC。内皮细胞分离的方案从Wu等人2003年修改。
1. 麻醉6-8成年小鼠根据适当的机构指南。执行颈椎脱位。
2. 用70％乙醇喷洒头部以对该区域进行灭菌，以尽量减少毛皮的污染。
3. 用锋利的剪刀将鼠标打断在脑干的基部。
4. 沿着中线切开皮肤矢状，直到眼睛之间的任意点。暴露颅骨没有覆盖皮肤和皮下组织（图2C）。
5. 通过将剪刀的每个刀片放入每个眼腔，在眼睛之间切开颅骨。接下来，在沿着矢状缝线穿过颅骨切开后，在颅骨的基部进行两个横向切割。
6. 暴露大脑通过用剪刀或镊子回去的头骨，并用小刮刀从头骨去除大脑（图2D）。
7. 用PBS冲洗大脑，转移到Falcon管用PBS/2％FBS，保存在冰上。
8. 收集所有脑后，将一个脑转移到培养皿中，其中用填充有PBS/2％FBS的滤盘填充。
9. 用中脑和小脑的弯钳钳（图2F）。
10. 用细毛刷清除脑膜和任何可见表面血管，大血管将容易被捕获在滤盘上（图2G-H）。
11. 用刷子去除胼the体的白质束（图2I）。
12. 转移组织现在到一个新的培养皿，保持皮质组织在冰上，直到进一步处理。继续以相同的方式处理大脑的其余部分（图2J）。
13. 处理所有脑样品后，用手术刀将皮质组织切成小块。使用带有松散杵的dounce匀浆器通过施加6-8次冲程使组织在2ml PBS/2％FBS中匀浆化（图2K-L和3A）。
14. 混合组织匀浆（应该?3毫升）与3毫升30％葡聚糖，得到15％的最终浓度（图3B）。
15. 将混合物转移到2ml Eppendorf管中，并在6℃下以4℃离心20分钟（图3C，离心后的管）。
16. 用1ml移液管小心地除去厚的上清液或通过使用真空泵抽吸（图3D-E）。小心从壁上适当地去除组织匀浆。用1ml移液管通过快速吸移上下吸取，用含2％FBS的PBS重悬浮松散的沉淀（图3F）。
17. 将100微米无菌尼龙细胞过滤器倒置在50ml管的顶部。将溶液过滤通过100μm过滤器，并用至少10ml含有2％FBS的PBS充分洗涤。标签管作为"流过1"并保持在冰上直到进一步处理（图3G）。
18. 取100微米过滤器，将其翻转成标记为"周细胞/vSMC"的新的50ml管（图3H）。用至少10ml含有2％FBS的PBS充分洗涤过滤器（图3I）。
19. 保持大容器在溶液（周细胞/vSMC）在冰上，直到离心
20. 取流过1并过滤通过40μm无菌尼龙细胞过滤器（再次将其倒在50ml管上）（图3J），用含有2％FBS的PBS洗涤以除去单个细胞和碎片。
21. 可以丢弃流出物，并且将40μm尼龙过滤器翻转并插入新的50ml管中。
22. 用至少10ml含有2％FBS的PBS彻底洗涤尼龙膜，使所有微血管回到溶液中，标记管"内皮细胞"。
23. 通过在4℃下以800×g离心5分钟来旋转两个管。
24. 通过溶解1毫克/毫升胶原酶A在相应的生长培养基内生长和周细胞培养基中，而不添加生长因子制备胶原酶溶液。在37℃最好溶解（见配方3和4）。
  注意：胶原酶溶液的体积取决于我们使用的丸粒大小，每个丸/细胞类型3-4ml。
25. 将来自步骤B23的容器沉淀溶解在各自的胶原酶溶液中。孵育在15毫升管中的溶液中的血管4-5小时，在37℃下管旋转器（图3K-L）。在用1ml移液管向上和向下用力吸取以破碎细胞团块之间。小心，容器不要连接到移液器吸头。每小时一次，5次上下，在大多数情况下是足够的。
26. 在800×g下旋转细胞5分钟，除去上清液并将沉淀溶解在含有生长因子的相应生长培养基中。
27. 将板内皮细胞在12孔板的一个PDL /层粘连蛋白包被的孔中，并在37℃，5％CO 2过夜，在24孔板的两个未涂布孔上形成周细胞/平滑肌细胞。
28. 第二天将上清液转移到同样培养皿的新孔中，其也用PDL /层粘连蛋白（但是仍含有层粘连蛋白培养基，直到使用）包被内皮细胞或未包被于周细胞/vSMC。添加新鲜生长培养基与生长因子。
29. 每3-4天更换培养基。小细胞需要几天，直到它们开始增殖。不要分裂细胞，直到转移到共培养悬挂插入。它们应当以高密度生长以增殖（图4显示初始细胞阶段）。
星形胶质细胞的分离
注意：可以在图1中找到隔离程序的概述。初始步骤与神经球隔离的相同，您可以在Babu等人，2011年的视频中看到如何解剖海马。/em>
1. 在共培养前两周从四只4周龄小鼠分离星形胶质细胞。
2. 麻醉成年小鼠根据适当的机构指南。执行颈椎脱位。
3. 用70％乙醇喷洒头部以对该区域进行灭菌，以尽量减少毛皮的污染。
4. 用锋利的剪刀将鼠标打断在脑干的基部。
5. 沿着中线切开皮肤矢状，直到眼睛之间的任意点。暴露颅骨没有覆盖皮肤和皮下组织。
6. 通过将剪刀的每个刀片放入每个眼腔，在眼睛之间切开颅骨。接下来，在沿着矢状缝线穿过颅骨切开后，在颅骨的基部进行两个横向切割。
7. 暴露大脑通过用剪刀或镊子回去的头骨，并用小刮刀从头骨去除大脑。
8. 用PBS冲洗大脑，转移到含有PBS的塑料盘。
9. 在低放大倍率下将含有脑的培养皿放置在解剖显微镜下，并将脑定位在其腹侧表面上。使用精细弯曲的钳子删除嗅球，同时通过小脑保持大脑的位置。
10. 将大脑旋转到背部方面，并使用解剖刀在视交叉的水平做出冠状切口通过大脑。
11. 将大脑的尾部置于培养皿中，使用手术刀沿纵向裂缝切开。
12. 在解剖显微镜下，用镊子取出小脑和间脑。
13. 通过用27 G针在海马结构周围滑动来移除海马。使用细镊子，从周围组织的海马，取出附加的髓磷脂床单（白质），可以沿着海马的内侧边缘和背面找到。
14. 将解剖的海马放置在充满HBSS的冰上的Eppendorf管中，直到所有的海马解剖。
15. 通过加入50μl酶P和1,900μl缓冲液X加2μlβ-巯基乙醇从神经元组织解离试剂盒制备酶混合物1。涡旋并在37°C预热混合物10-15分钟，然后使用。
16. 从海马小心地取出HBSS，并使用手术刀刀片在培养皿中切碎组织，直到没有大块剩余。
17. 使用转移移液管将切碎的组织转移到15ml Falcon管中，加入预热的酶混合物1.
18. 在37℃下用管旋转器连续振荡孵育15分钟。
19. 通过加入40μl缓冲液Y和20μl酶A从神经元组织解离试剂盒制备酶混合物2
20. 添加酶混合物2.
21. 使用中型火抛光移液管缓慢研磨10次。
22. 在37℃孵育10分钟。
23. 使用小型火抛光移液器缓慢研磨10次。
24. 通过加入HBSS缓冲液至终体积为10ml来洗涤细胞。
25. 将溶液中的细胞应用于40μm细胞过滤器，用额外的4ml HBSS洗涤过滤器。
26. 将细胞在15ml管中以300×g离心5分钟
27. 除去上清液，并用10ng/ml EGF和2％FBS在适当量的星形胶质细胞培养基（见配方5）中重悬沉淀。
28. 种子在12孔板的PDL包被的板的一个孔上，并在37℃下用5％CO 2孵育。
29. 36小时后取出培养基，用预热的PBS彻底洗涤剩余的贴壁细胞，加入含有5ng/ml EGF和0.5％FBS的新鲜培养基。
30. 每3天更换培养基，在共培养实验中使用前不要传代细胞（见图5代表性图像）
将小生境共培养细胞接种到细胞插入物中
1. 在共培养前两天用accutase或胰蛋白酶从不同的制剂中分离细胞注意：我们使用accutase星形胶质细胞制剂和胰蛋白酶内皮和周细胞制备。
2. 种子?5,000个细胞/悬挂插入物在它们各自的生长培养基中用于不同的细胞培养物（每个插入物约100μl，参见用于培养基组合物的配方3-5），没有培养基放置在悬挂插入物下面的孔中。
3. 在共培养前5-10小时，从悬挂的插入物（通过抽吸或用移液管）中取出相应的生长培养基，并且用不含任何生长因子的B27（参见配方6）替换DMEM。
隔离海马前体细胞神经球共培养测定
神经前体细胞的分离程序根据Babu等人的方案。（2011），Walker和Kempermann（2014）轻微修改。
1. 麻醉一个成人6至8周龄小鼠根据适当的机构指南。执行颈椎脱位。
2. 用70％乙醇喷洒头部以对该区域进行灭菌，以尽量减少毛皮的污染。
3. 用锋利的剪刀将鼠标打断在脑干的基部。
4. 沿着中线切开皮肤矢状，直到眼睛之间的任意点。暴露颅骨没有覆盖皮肤和皮下组织。
5. 通过将剪刀的每个刀片放入每个眼腔，在眼睛之间切开颅骨。接下来，在沿着矢状缝线穿过颅骨切开后，在颅骨的基部进行两个横向切割。
6. 暴露大脑通过用剪刀或镊子回去的头骨，并用小刮刀从头骨去除大脑。
7. 用PBS冲洗大脑，转移到含有PBS的塑料盘。
8. 在低放大倍率下将含有脑的培养皿放置在解剖显微镜下，并将脑定位在其腹侧表面上。使用精细弯曲的钳子删除嗅球，同时通过小脑保持大脑的位置。
9. 将大脑旋转到背部方面，并使用解剖刀在视交叉的水平做出冠状切口通过大脑。
10. 对于齿状回的显微切片（更多细节参见Walker和Kempermann，2014）将脑的尾部置于培养皿中，并使用手术刀沿着纵向裂缝切割。
11. 用钳子在解剖显微镜下取下小脑和间脑。
12. 要去除齿状回，插入27 G针头的尖端，沿齿状回和Ammon号角之间的边界滑动。使用细镊子，从周围的组织取牙。
13. 将解剖的齿状回置于带有HBSS的培养皿中的冰上。
14. 通过加入25μl酶P和950μl缓冲液x加1μlβ-巯基乙醇从神经元组织解离试剂盒制备酶混合物1。涡旋并在37°C预热混合物10-15分钟，然后使用。
15. 取出HBSS，并使用手术刀刀片切碎组织，直到没有更大的碎片剩下。
16. 将切碎的组织从一只老鼠转移到15毫升Falcon管，并加入预热的混合物1
17. 在37℃下用管旋转器连续振荡孵育15分钟。
18. 通过加入20μl缓冲液Y和10μl酶A从神经元组织解离试剂盒制备酶混合物2
19. 添加酶混合物2.
20. 使用中型火抛光移液管缓慢研磨10次。
21. 在37℃下用管旋转器连续振荡孵育10分钟。
22. 使用小型火抛光移液器缓慢研磨10次。
23. 通过加入HBSS缓冲液至终体积为10ml来洗涤细胞。
24. 将溶液中的细胞应用于40μm细胞过滤器，用额外的4ml HBSS洗涤过滤器。
25. 离心在15ml管中的细胞在300×g离心5分钟。
26. 除去上清液并将沉淀重悬在适量的DMEM培养基中（参见配方6），加入20ng/ml EGF，20ng/ml bFGF和2μg/ml肝素。
  注意：根据将要分析多少共培养条件，滴定培养基的体积，使得每24孔接种足够但不太多的细胞，否则球体开始融合。每24孔需要使用至少500μl培养基以接触悬挂细胞插入物
Hippocampal niche neurosphere co-cultural
1. 转移500微升神经细胞悬液（从步骤E26）在含有生长因子的DMEM培养基中的24孔板的每个孔。
  注意：接种的孔数取决于共培养条件的数量;在我们的实验中，我们将来自一只动物的神经球接种到24孔板的12个孔中（使用6种不同的共培养条件）。不要忘记一个或两个参考井无共同培养的细胞，其中只有干细胞和祖细胞接种，但只有一个空悬挂插入物与培养基放置在顶部。这些参考孔中的神经球的生长可以作为基线，以评价利基共培养物的影响。
2. 在37℃下用5％CO 2孵育30分钟
3. 在来自分离的细胞沉降后，将具有合适细胞的悬挂插入物添加到没有生长因子的DMEM/B27中，并在37℃下用5％CO 2孵育10天。 10天后取出悬挂的插入物并在倒置显微镜上使用具有刻度板内部的10x物镜计数和测量球体。
  注意：为了更容易地分析24孔板表面上的球体数量绘制网格线，或使用具有网格线的透明度（图6）。
4. 对于分化的进一步分析，从孔中移除含有球体的培养基，并在300×g离心5分钟。
5. 重悬在含有B27但不含生长因子的DMEM培养基中，并转移到具有玻璃底部或含有盖玻片（都需要用层粘连蛋白包被）的24孔板中。
6. 在37℃，5％CO 2下大约7天后，可以分析成神经元和星形胶质细胞。因此，用4％多聚甲醛（预热至37℃）和针对Map2ab和GFAP的染色来固定细胞（详见Walker和Kempermann，2014）。

代表数据

图1.神经球共培养测定的分离范例。图示概述了原代细胞分离模式和组织来源，其可以用于这种神经球共培养测定。外周细胞/血管平滑肌细胞（vSMC）和内皮细胞可以从皮层分离，星形胶质细胞从海马中分离，齿状回用于分离神经球。将细胞接种到transwell悬挂插入物中，而将分离的干细胞接种在下面

图2.第1部分 - 内皮细胞和周细胞/vSMC的分离。内皮细胞和周细胞/vSMC方案的逐步程序。 A.葡聚糖的无菌过滤。 B.隔离所需的一套仪器。 C.矢状切开通过头骨和剥皮的皮肤和头骨。 D.从头骨中除去大脑。 E.冠状动脉用手术刀切开大脑。 F.用镊子摘下中脑。 G.用细毛刷除去可见表面血管。 H.刷牙后在表面上看不见血管。 I.用刷子去除髓磷脂片（胼（体的白质）。 J.在冰上用PBS/FBS将处理过的皮质转移到新的培养皿中。 K.用手术刀切割皮质。 L.将组织转移到douncer。

图3.第2部分 - 内皮细胞和周细胞/vSMC的分离周细胞/vSMC和内皮细胞分离的逐步程序的第二部分。 A.用松散的杵均质化douncer中的组织。 B.将组织与30％葡聚糖混合1：1。离心后，可以在底部观察到红色血管沉淀，并且组织匀浆浮在顶部。 D.小心吸出组织匀浆和蔗糖。 E.可以在底部找到清洁的容器颗粒。 F.在PBS/FBS中重悬血管沉淀。 G.通过100微米的尼龙过滤器过滤容器在溶液中，上下颠倒。 H.取一个新的管，翻转在上面安全地转移大容器到它。 I.冲洗过滤器，直到所有容器都移回溶液中。 J.从上一步转移到40μm过滤器。在大小容器级分离心后，可以发现颗粒。这些颗粒现在重悬在胶原酶溶液中消化。 L.将容器准备的试管转移到培养箱中的旋转振荡器中

图4.血管消化后的内皮细胞和周细胞培养物。在早期制备时间点期间内皮细胞和周细胞/vSMC的代表性图像。在内皮细胞（上图）分离和周细胞/vSMCs分离的关键步骤期间拍摄的图像（下图）。比例尺，10μm

图5.星形胶质细胞分离。在早期制备时间点的星形胶质细胞的代表性图像。在星形胶质细胞分离的关键步骤期间拍摄的图象。比例尺，10μm

图6.神经球共培养分析。通过放置网格线进行神经球共培养分析。左，24孔板下的网格线。中间，一口井的特写镜头视图。右，通过显微镜用可见的网格线查看。比例尺，500μm

笔记

为了确认不同的原代细胞制备物的富集和可持续性，总是将一些细胞接种到PDL /层粘连蛋白包被的载玻片上以通过免疫细胞化学来评估制备，或取样品用于RNA分离（详见原始出版物Ehret等人。，2015）。

食谱

含2％FBS的PBS
将1ml无菌过滤的FBS加入到49ml高压灭菌的PBS中
30％葡聚糖溶液将0.9g葡聚糖（平均分子量150000）溶于3ml HBSS中
在振荡器上溶解过夜，用尖端过滤器过滤灭菌并在4℃下储存最多3天
内皮细胞培养基（用于内皮细胞培养）
MCDB131媒体
5％血浆来源的血小板血清
15 U/ml肝素 ITS预混物（5μg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白和5ng/ml硒）（100×储液）
100U/ml青霉素/链霉素（100x原液）使用前，加入10 ng/ml EGF，10 ng/ml FGF碱性和5 ng/ml VEGF
Pericyte/vSMC媒体
含glutamax的DMEM（100x储备液）
10％FBS
0.1mM非必需氨基酸（100x原液）
100U/ml Pen/Strep（100×储备液）在使用前，加入10 ng/ml VEGF
星形细胞媒介
含谷氨酰胺和HEPES的DMEM
Glutamax（100x股票）
B27（50x股票）
生长因子（EGF和FBS）在使用前加入，对于不同浓度，参见步骤C27-29
神经球媒体
不含谷氨酰胺的DMEM
B27（50x股票）
Glutamax（100x股票）
笔/Strep（100x股票）
在即将使用之前加入生长因子（EGF和FGF各20μg/ml）

致谢

该方案用于我们先前发表的研究中（Ehret等人，2015）。这项工作由DZNE的基本机构赠款资助。

参考文献

Babu，H.，Claasen，JH，Kannan，S.，Runker，AE，P??almer，T。和Kempermann，G（2011）。用于从小鼠齿状回分离和富集单层培养神经前体细胞的方案。前脑神经瘤 5 ：89.

Ehret，F.，Vogler，S.和Kempermann，G.（2015）。

Walker，TL和Kempermann，G.（2014）。一只小鼠，两种培养物：从单个小鼠的两个神经源区分离和培养成熟神经干细胞。（84）：e51225。

Wu，Z.，Hofman，FM和Zlokovic，BV（2003）。一种用于分离和表征小鼠脑微血管内皮细胞的简单方法。 J Neurosci Methods 130（1）：53-63。